申请/专利权人：合肥元哉生物科技有限公司

申请日：2023-03-23

公开（公告）日：2023-05-30

公开（公告）号：CN116180244A

主分类号：C40B50/06

分类号：C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.06.16#实质审查的生效;2023.05.30#公开

摘要：本发明涉及高通量测序技术领域，且公开了一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，包括以下步骤：S1、将一定量的样品使用核酸提取试剂盒提取DNA，使用Qubit3.0荧光定量仪检测基因组DNA总量，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，选择高质量的DNA进一步实验。本发明通过设计随机不等碱基差异序列组合和i5‑index和i7‑index最优index组合，实现phix碱基平衡文库添加比例由30％减少到10％，MiseqPE300测序有效数据产量由8～10G提升到12～14G，整体Q30％＞80％，Read1I即i7‑index的Q30％由75％提升到90％以上；Read2I即i5‑index的Q30％由60％提升到80％以上。

主权项：1.一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将一定量的样品使用核酸提取试剂盒提取DNA，使用Qubit3.0荧光定量仪检测基因组DNA总量，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，选择高质量的DNA进一步实验；S2、采用PAGE合成方式合成测序引物，测序引物包含内引物、外引物，其中内引物由扩增区域、差异序列和搭桥区域组成，差异序列为适用于16SrDNA的V3-V4区的1～7bp不等碱基差异序列，外引物由搭桥区域、index序列、测序接头组成，index序列为最优i5-index和i7-index组合；S3、PCR产物建库：针对S1中选择的高质量DNA样品的16SrDNA的V3-V4区域进行扩增，通过内外两组扩增引物经过两步扩增完成文库构建，内引物扩增16SrDNAV3-V4区，外引物携带测序Adapter序列，扩增时外引物利用搭桥区域对内引物的扩增产物再进行扩增，以此实现16SrDNA的V3-V4区域的富集和样本的区分；S4、融合引物建库：将16SrDNA的V3-V4区扩增引物序列与测序Adapter序列融合成一组较长的融合引物，针对S1中选择的高质量的DNA样品的16SrDNA的V3-V4区域进行测序，通过一步扩增完成文库构建；S5、质检和测序：使用胶回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收范围为500-750bp，DNA回收后，对切胶文库进行质检，质检合格后，以28pM的文库浓度上机测序，测序平台为Illumina的Miseq平台，测序策略为PE300，具体采用PE301+8+8+301，Miseq测序过程中，AC共用红激光，GT共用绿激光；S6、数据质量产量对比分析：对比使用普通差异序列组合和最优差异序列组合的Miseq下机数据质量和产量差异；对比普通i5-index、i7-index组合和最优i5-index、i7-index组合的Miseq下机数据中index数据质量Q30％差异；S7、数据分析：采用Kolmogorov-Smirnov检验和皮尔逊相关系数，从科和属水平上对来自16S扩增子测序数据的OTUs进行总体比较。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 合肥元哉生物科技有限公司 一种高通量微生物16S rRNA扩增子文库半自动化构建方法

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