申请/专利权人：中山大学

申请日：2019-04-29

公开（公告）日：2023-06-06

公开（公告）号：CN110229816B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867;C12N9/22;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.06.06#授权;2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.13#公开

摘要：本发明提供了一种用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示序列中的至少一条。本发明还提供了一种敲除人肝癌细胞RBP4基因的方法，为利用CRISPRCas系统在人肝癌细胞中对RBP4基因进行改造。本发明还提供了一种RBP4基因缺失细胞株，RBP4是一种新型脂肪因子，具有干扰糖脂代谢的功能，还能负性调节胰岛素信号通路进而引起胰岛素抵抗的发生。本发明提供的RBP4基因敲除细胞株为研究RBP4基因提供了有效的平台，有望为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。

主权项：1.一种用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQIDNO:3所示。

全文数据：用于敲除人RBP4基因的sgRNA、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及应用技术领域本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及其应用。背景技术CRISPRCas9系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入，这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能表达与入侵者基因组序列相识别的RNA，在CRISPR相关酶CAS9的作用下切割外源基因组DNA，达到抵制入侵的目的，经过人为改造后，CRISPRCas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型。现有实验技术中，与CRISPRCas9系统最为相似的是siRNA靶向的基因沉默技术。siRNA是指生物在进化过程中高度保守的双链RNA诱发的基因沉默现象，其影响生物体一系列过程和功能，但在药物等的诱导作用下，被沉默的基因会出现表达回复的现象。与siRNA靶向mRNA抑制基因表达相比，CRISPRCas9系统在基因组水平进行基因编辑，可以完全沉默基因的表达，构建真正的基因缺陷型细胞株。视黄醇结合蛋白4RBP4是视黄醇、维生素A等的特异性运载蛋白。RBP4是一种新型脂肪因子，具有干扰糖脂代谢的功能，还能负性调节胰岛素信号通路进而引起胰岛素抵抗的发生。RBP4基因位于染色体10q23～q24区域，该区域的基因大都与2型糖尿病的发生发展有关。研究RBP4基因有望为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。因此有必要研制一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的RBP4基因缺失细胞株，期望通过研究RBP4基因缺失细胞株为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。发明内容有鉴于此，本发明提供了用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及其应用。本发明第一方面提供一种用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示序列中的至少一条。本发明第二方面提供一种敲除人RBP4基因的方法，为利用CRISPRCas系统在人肝癌细胞中对RBP4基因进行改造，具体包括如下步骤：1人工合成如本发明第一方面所述靶DNA序列及其互补链；2将所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；3将sgRNA重组质粒转染人肝癌细胞，即得敲除RBP4基因的人肝癌细胞。在本发明一实施例中，所述步骤2具体包括：将所合成的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2及SEQIDNO:3所示序列的核酸对分别插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；在本发明一实施例中，所述步骤3具体包括：将步骤2所得的sgRNA重组质粒共转染人肝癌细胞，即得敲除RBP4基因的人肝癌细胞。第三方面，本发明提供一种RBP4基因缺失细胞株的构建方法，为采用慢病毒转染法对本发明第二方面所得的敲除RBP4基因的人肝癌细胞进行传代筛选，获得稳定敲除RBP4基因的人肝癌细胞。第四方面，本发明提供一种RBP4基因缺失细胞株，为采用本发明第三方面所述的RBP4基因缺失细胞株的构建方法所制得。第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列、如第二方面所述的敲除人RBP4基因的方法、如本发明第三方面所述的RBP4基因缺失细胞株的构建方法或如本发明第四方面所述的RBP4基因缺失细胞株在敲除RBP4基因中的应用。第六方面，本发明提供一种用于在人基因组中进行RBP4基因定点敲除试剂盒，包括如下1-3中的任一种：1如第一方面所述的用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列；2如第二方面所述的sgRNA重组质粒；3如第四方面所述的RBP4基因缺失细胞株。本发明提供的技术方案具有如下有益效果：本发明提供的技术方案利用CRISPRCas9技术对RBP4基因敲除，实现了在基因组水平对基因的沉默作用，有效改进了siRNA在mRNA或蛋白水平的沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点。附图说明图1为本发明实施例提供的SURVEYOR核酸酶消化后PCR片段结果；图2为本发明实施例提供的RBP4基因敲除的HepG2稳定株T-A克隆测序结果，其中图2a为RBP4基因敲除的HepG2稳定株T-A克隆编号1、2、3的测序结果，图2b为RBP4基因敲除的HepG2稳定株T-A克隆编号4、5、6的测序结果，图2c为RBP4基因敲除的HepG2稳定株T-A克隆编号7、8、9的测序结果；图3为本发明实施例提供的RBP4基因敲除的HepG2细胞株mRNA表达量检测结果；图4为本发明实施例提供的RBP4基因敲除的HepG2细胞株Protein表达量检测结果。具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。1sgRNA设计：本研究中应用http:crispr.mit.edu网站针对RBP4的第三外显子Exon3设计sgRNA序列。设计方法：1在NCBI上查找RBP4基因第三外显子Exon3的序列。2将NCBI发布的Exon3的序列提交至上述网站，提交后网站会自行进行sgRNA设计，根据网站设计的结果，分别选择评分较高的一对序列一般选择评分80。3分别在sgRNA两端加酶切位点，在每条sgRNA序列的正义链的5’端添加CACC，反义链的5’端添加AAAC，从而形成与pLentiCRISPRv.2质粒经FastDigestBsmbI酶切后互补的粘性末端。如果正义链的5’端第一个碱基不是G，则在5’端CACC后面增加一个G，相应的反义链3’端再增加一个C。设计完成后的带酶切位点的sgRNA送上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。三组针对RBP4的Exon3的带酶切位点的sgRNA序列具体分组与命名见下表：表1RBP4sgRNAoligo序列本发明SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示序列分别对应表格1中SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8画横线部分，具体地，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示序列分别为GAGTTCTCCGTGGACGAGAC、CTTCTTGGCCATGGCGTACC、CATCGTCGCGGAGTTCTCCG。2重组质粒的构建与鉴定1pLentiCRISPRv.2addgene公司，货号52961质粒是含有U6启动子的sgRNA骨架表达载体，表达具有切割DNA双链产生DNA双链断裂DNADoubleStrandBreak，DSB的Cas9核酸酶，带有氨苄青霉素抗性及嘌呤霉素抗性。用FastDigestBsmbI对pLentiCRISPRv.2进行酶切，DNA凝胶电泳后回收线性化的载体。2用T4PNK分别对表1中的sgRNAoligo序列分别进行磷酸化和退火；用T4ligase将线性的pLentiCRISPRv.2质粒载体分别与退火后的三组sgRNA双链序列于16℃连接2h。连接产物转化感受态细菌Trans109，冰浴30min,然后水浴42℃热应激45s，冰上2min。在含氨苄抗性的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆摇菌，送北京六合华大基因公司测序。测序正确的克隆提取重组质粒。3所得重组质粒共有三组，针对pLentiCRISPRv.2质粒所得重组质粒命名为pLentiCRISPRv.2-sgRNA1、pLentiCRISPRv.2-sgRNA2和pLentiCRISPRv.2-sgRNA3。3慢病毒系统病毒液构建HepG2稳定细胞株1病毒的产生：293FT细胞培养条件是DMEM培养基含10％胎牛血清、5％CO2、37℃恒温培养。分别在10cm细胞培养皿中接种293FT细胞，细胞接种数为2×106，保证第二天细胞融合度达到60％左右。将核心质粒pLentiCRISPRv.2-sgRNA或pLentiCRISPRv.2、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G按照4:3:2的比例共转染HEK293FT细胞。sgRNA组核心质粒分别为pLentiCRISPRv.2-sgRNA1、pLentiCRISPRv.2-sgRNA2和pLentiCRISPRv.2-sgRNA3,以pLentiCRISPRv.2作为对照组。在转染后24h，48h和72h连续收集3次病毒液，每次收集的病毒液需用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片及其他杂质。利用倒置荧光显微镜观察荧光细胞百分比，确定转染效率。2细胞感染和HepG2稳定株细胞筛选：HepG2细胞培养条件是DMEM培养基含10％胎牛血清、5％CO2、37℃恒温培养。提前一天按2×105孔将HepG2细胞种于6孔板内，细胞感染时细胞融合度达到30％为宜。感染前用新鲜培养基等体积混合病毒原液，加入2μl10mgml的聚凝胺终浓度为10μgml混匀后，加入六孔板内。如此反复感染三次。感染后待细胞融合度达到80-90％后，用终浓度为1μgml的嘌呤霉素对感染后细胞进行筛选。药筛5天后用0.2μgml的嘌呤霉素进行维持HepG2稳定细胞株。4提取细胞基因组DNA将所构建的细胞株进行消化，用GeneJETTMGenomicDNAPurificationKit提取基因组DNA。1将细胞收集于离心管，每管5×106个细胞，用移液器缓慢吹打，250g离心5min，弃上清，加PBS重悬细胞，再次重复离心，已去除细胞中残留培养基。2用200μlPBS重悬细胞，每管加入200μl裂解液和20μl蛋白酶K，充分震荡、混合均匀。356℃摇床孵育10min，期间每3-4分钟震荡混匀一次，以保证细胞裂解充分。4加入20μlRNAaseA，震荡混匀，室温孵育10min。5加入400μl50％ethanol，用枪震荡混匀或者震荡混匀。6将上述MiX加入试剂盒提供的Column柱中，6000g离心，1min，将DNA收集柱转移至新的2ml收集管中。7加入500μlwashbufferI，8000g离心1min，弃废液。再加入500μlwashbufferII,12000g,离心3min。8加入200μlElutionBuffer至收集柱滤膜中央，室温孵育2min，8000g离心，1min，即可得所需DNA样品。5PCR反应条件和SURVEYOR分析检测1根据NCBI提供的RBP4基因mRNA序列号设计QRT-PCR引物；通过Primer3.0设计RBP4基因的SURVEYOR引物和PCR引物，引物由上海捷瑞生物公司合成。表2SURVEYORPCR反应引物序列2用Phusion超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，参照说明书50μl体系，基因组DNA100ng，50μl反应体系如下表所示。组分数量5×PhusionHFbuffer10μldNTPs,2.5mM4μlForwardprimerF+R，10uM2.5μltemplateDNA100ngddH2OUpto50μl程序如下：取反应后PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。SURVEYOR分析步骤如下：1用QIAquickPCRpurificationKit试剂盒进行PCR产物纯化，将回收产物稀释至40ngul，按照SURVEYOR分析试剂盒说明书步骤进行检测.2DNA杂化双链形成退火反应体系：组分数量μl10×TaqPCRbuffer2纯化后PCR产物，50ngμl-118Totalvolume20反应条件：循环次数条件195℃,10min295-85℃,-2℃s-1385℃,1min485-75℃,-0.3℃s-1575℃,1min675-65℃,-0.3℃s-1765℃,1min865-55℃,-0.3℃s-1955℃,1min1055-45℃,-0.3℃s-11145℃,1min1245-35℃,-0.3℃s-11335℃,1min1435-25℃,-0.3℃s-11525℃,1min1625-4℃,-0.3℃s-1174℃,hold3使用SURVEYOR试剂盒提供的核酸酶酶切杂化产物，体系如下：反应条件：充分震荡、混匀上述mixture,42℃30min。4取10ul样品，用2.5％琼脂糖凝胶进行分析。用凝胶定量软件ImageLab进行灰度分析，计算切割效率，公式为fcut＝b+ca+b+c，其中Indel为缺失比率，fcut为切割比率，a为未被切割条带的灰度值，b和c表示切割产生的新条带的灰度值。选择Indel％最高的那一组转染的293FT细胞做下一步的接种和筛选。SURVEYOR核酸酶消化部分结果如图1所示，实验结果表明：针对Exon3设计的sgRNA构建的pLentiCRISPRv.2-sgRNA1、pLentiCRISPRv.2-sgRNA2和pLentiCRISPRv.2-sgRNA3质粒组均有效，SURVEYOR结果为阳性，其中经pLentiCRISPRv.2-sgRNA3质粒处理后，Indel％最高，故选择pLentiCRISPRv.2-sgRNA3质粒组转染的293FT细胞做下一步的接种和筛选。6RBP4基因敲除的HepG2细胞株DNA测序分析1使用NEB公司Taq酶对RBP4第三外显子区域进行PCR扩增，反应体系：2将PCR产物连入试剂盒提供的T载体中，连接体系如下：反应条件：室温22-30℃反应1-5分钟。3将连接液导入感受态细胞，冰浴30分钟后再42℃水浴热激45秒，迅速转移回冰浴中，静置2分钟；再加500μl不含抗生素的无菌LB培养基，将其置于37℃，300rpm摇床上摇菌一个小时。吸取500μl菌液均匀涂布到含抗生素的LB培养平板上；倒置平板，放于37℃过夜培养，次日挑单克隆送测序。结果如图2a、图2b、图2c所示，HepG2稳定株在靶点位置造成了的缺失突变，实现RBP4基因敲除。8RBP4基因敲除的HepG2细胞株mRNA和蛋白表达量检测1使用Trizol法提取细胞总RNA，使用TOYOBO公司逆转录试剂盒进行逆转录，生成cDNA，按照TOYOBO公司SYBRmix试剂说明书给出的体系进行qRT-PCR。根据NCBI提供的RBP4基因mRNA序列号设计qRT-PCR引物；采用TOYOBO反转录试剂盒逆转录得到cDNA，体系如下：按照TOYOBO的SYBRMix试剂盒说明书上的体系进行实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCRVII7仪器PCR反应循环条件如下：结果如图3所示，成功构建RBP4基因敲除的HepG2细胞株mRNA表达量明显低于对照组。2使用M-PER细胞裂解液提取HepG2RBP4基因敲除细胞株总蛋白，使用上海碧云天生物技术有限公司的BCA蛋白定量试剂盒进行定量，随后进行WesternBlotting。配置X％的分离胶8mL：用Bio-Rad制胶架固定，上层用无水乙醇封液面，37℃放置30min左右待胶完全凝固。配置4％的浓缩胶6mL：灌胶后插入加样梳，37℃放置30min左右待胶完全凝固。样品处理及上样：按30μg孔的蛋白量计算蛋白体积，加5×SDS缓冲液10μl再用蛋白裂解液补足总体积到20μl。98℃高温变性8分钟，12,000rpm离心1分钟后缓慢加入上样孔。结果如图4所示，成功构建RBP4基因敲除的HepG2细胞株蛋白表达量明显低于对照组。上述结果表明本发明提供的RBP4基因缺失细胞株的构建方法是一种高效的基因敲除方法，传统的基因敲除方法不仅流程繁琐，对技术要求高，而且费用昂贵，成功率相对较低。本发明采用的CRISPR-Cas9技术是第四代基因编辑方法，其易于操作，效率更高，费用低廉。本发明利用CRISPR-Cas9技术构建的RBP4基因敲除细胞模型为RBP4代谢相关的研究提供了有效平台。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表中山大学用于敲除人RBP4基因的sgRNA、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及应用13SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1gagttctccgtggacgagac20220DNA人工序列ArtificialSequence2cttcttggccatggcgtacc20320DNA人工序列ArtificialSequence3catcgtcgcggagttctccg20425DNA人工序列ArtificialSequence4caccggagttctccgtggacgagac25525DNA人工序列ArtificialSequence5aaacgtctcgtccacggagaactcc25625DNA人工序列ArtificialSequence6caccgcttcttggccatggcgtacc25725DNA人工序列ArtificialSequence7aaacggtacgccatggccaagaagc25825DNA人工序列ArtificialSequence8caccgcatcgtcgcggagttctccg25925DNA人工序列ArtificialSequence9aaaccggagaactccgcgacgatgc251020DNA人工序列ArtificialSequence10ttcccctcccggtggtgagt201121DNA人工序列ArtificialSequence11gcacacgtcccagttactgca211220DNA人工序列ArtificialSequence12tgatcgtccacaacggttac201323DNA人工序列ArtificialSequence13gagctgaagactgagagctaatc23

权利要求：1.一种用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示序列中的至少一条。2.一种敲除人肝癌细胞RBP4基因的方法，其特征在于，为利用CRISPRCas系统在人肝癌细胞中对RBP4基因进行改造，具体包括如下步骤：1人工合成如权利要求1所述的靶DNA序列及其互补链；2将所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；3将sgRNA重组质粒转染人肝癌细胞，即得敲除RBP4基因的人肝癌细胞。3.一种RBP4基因缺失细胞株细胞株的构建方法，其特征在于，为采用慢病毒转染法对如权利要求2所得的敲除RBP4基因的人肝癌细胞进行传代筛选，获得稳定敲除RBP4的人肝癌细胞。4.一种RBP4基因缺失细胞株，其特征在于，为采用如权利要求3所述的RBP4基因缺失细胞株的构建方法制备所得。5.一种如权利要求1所述的用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列在敲除RBP4基因中的应用。6.一种用于在人基因组中进行RBP4基因定点敲除试剂盒，其特征在于，包括如下1-3中的任一种：1如权利要求1所述的用于敲除人RBP4基因的sgRNA序列；2如权利要求2所述的sgRNA重组质粒；3如权利要求4所述的RBP4基因缺失细胞株。

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