申请/专利权人：哈尔滨医科大学

申请日：2021-01-12

公开（公告）日：2023-06-06

公开（公告）号：CN112852854B

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C07K19/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.06.06#授权;2021.06.15#实质审查的生效;2021.05.28#公开

摘要：本发明公开了一种重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用。基于从干预或阻断SIRPα‑CD47相互作用方面入手，针对癌细胞膜和巨噬细胞膜上已知位点及可启动下游凋亡信号通路的经典理论，将TRAIL肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和SIRPα两个功能区的氨基酸序列进行重组，构建SIRPα‑TRAIL融合蛋白，目标是阻断SIRPα与CD47的结合，促进巨噬细胞吞噬，同时利用TRAIL竞争癌细胞膜上特异性死亡受体DR4DR5结合，不仅干预了CD47与SIRPα的结合，又能激活下游凋亡信号级联反应，促进癌细胞凋亡。重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的设计开辟一种新的抗肿瘤治疗策略，是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

主权项：1.一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法，其特征在于，所述重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；包括如下步骤：步骤1.SIRPα-TRAIL融合蛋白序列设计，查找TRAIL和SIRPα功能序；步骤2.将获得的基因片段融合；步骤3.构建带有His标签的pET28+-SIRPα-TRAIL的表达质粒；步骤4.SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立；步骤5.SIRPα-TRAIL融合蛋白inBL21DE3扩大培养的生长曲线；步骤6.鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白inBL21DE3诱导成功；步骤7.SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定；步骤8.SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解；步骤9.SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化；步骤10.融合蛋白的复性除盐；步骤11.冷冻干燥，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末；步骤4中SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立，具体内容如下：将提取的pET28+-SIRPα-TRAIL质粒转化入BL21DE3大肠杆菌感受态细胞，转化后的大肠杆菌划线涂抹于固体培养基上，37℃过夜培养后，观察转化结果提示转化成功；步骤5中SIRPα-TRAIL融合蛋白inBL21DE3扩大培养的生长曲线，具体内容如下：挑取上述固体培养基上的单一菌落，在20ml含KANA的液体培养基中培养6h活化菌种，将活化后的菌液按不同比例加入含KANA的液体培养基中，每隔2h，留取样本，培养10h，用酶标仪测量不同时间点的样品的OD值，绘制生长曲线，6h为菌种的对数生长期；步骤6中鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白inBL21DE3诱导成功，具体内容如下：将菌种扩大培养，取诱导前后大肠杆菌样品进行SDS-PAGE电泳，可见诱导后表达量明显增加，证明融合蛋白表达诱导成功；步骤7中SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定，具体内容如下：将活化后的SIRPα-TRAILinBL21DE3菌液取1mL，添加于100mLLB液体培养基中，培养12h，超声破碎大肠杆菌，取碎菌离心后上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白在沉淀中大量表达，而上清几乎没有表达，证明SIRPα-TRAIL为包涵体表达；步骤8中SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解，具体内容如下：将包涵体蛋白变为有生物活性的蛋白，首先是溶解包涵体，先将包涵体蛋白以2M尿素的缓冲液洗涤，尽可能洗涤除去在蛋白表达过程中包裹于包涵体外部的非目的性杂蛋白，然后利用8M尿素变性液将其溶解，取溶解后样品进行SDS-PAGE电泳，在SIRPα-TRAIL分子量处有蛋白表达，证明成功将包涵体表达变为可溶性表达；步骤9中SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化，具体内容如下：利用Ni柱亲和层析，将8M尿素溶解后的包涵体样品上样，选用不同浓度咪唑缓冲液洗脱Ni层析柱，低浓度的咪唑缓冲液将非目的性杂蛋白洗脱下，高浓度的咪唑缓冲液将SIRPα-TRAIL融合蛋白洗脱下来，将洗脱下的样品进行SDS-PAGE电泳，证明纯化出较为纯净的SIRPα-TRAIL融合蛋白；步骤10中融合蛋白的复性除盐，具体内容如下：将第一次Ni柱亲和层析纯化SIRPα-TRAIL融合蛋白加至G25层析柱中，加入缓冲液洗脱层析柱，将样品复性并除去咪唑和尿素，得到浓缩的SIRPα-TRAIL融合蛋白样品，将得到的样品进行SDS-PAGE电泳，分子量36kDa处即为SIRPα-TRAIL融合蛋白；步骤11中冷冻干燥，具体内容如下：将过完G25所得的融合蛋白冷冻干燥36小时后，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 哈尔滨医科大学 一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD