申请/专利权人：IFP 新能源公司

申请日：2018-09-27

公开（公告）日：2023-07-04

公开（公告）号：CN109576323B

主分类号：C12P19/14

分类号：C12P19/14;C12P19/02

优先权：["20170928 FR 1759033"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.07.04#授权;2020.09.15#实质审查的生效;2019.04.05#公开

摘要：本发明涉及酶法水解的顺序进料方法，其中在搅拌下，使经预处理的木质纤维素基料在反应器中与水和酶接触，所述方法的特征在于向反应器顺序添加经预处理的木质纤维素基料以随时间逐渐延长的方式进行，从而获得预定的最终干物质含量。

主权项：1.酶法水解经预处理的木质纤维素基料的方法，包括在搅拌下，使所述至少一种经预处理的木质纤维素基料在反应器中与水和酶接触，所述至少一种经预处理的木质纤维素基料来自未加工的或经处理的木材、海洋生物质或农业副产品，所述方法包括以顺序间歇方式将所述至少一种经预处理的木质纤维素基料添加至反应器，使得间歇添加之间的间隔在所述方法内随时间延长，和获得高于12重量％的预定的最终干物质含量。

全文数据：随时间逐渐延长地添加经预处理的基料的酶法水解的顺序进料方法技术领域本发明涉及如下定义的以顺序供应模式由经预处理的木质纤维素基料substrate进行的酶法水解方法，使得所述纤维素转化成葡萄糖。然后，所述葡萄糖可以在各种进一步的步骤中，例如在生产醇的发酵步骤中使用，或用于生产化学中间体。背景技术开发改质木质纤维素生物质的经济上可行的方法目前是“热门话题”。化石资源的不断短缺和与食物供应的竞争已经导致研究生产生物燃料和化学中间体的新途径。从二十世纪七十年代以来，在组分多糖水解成糖之后的木质纤维素生物质的转化就已经成为很多研究的主题。木质纤维素生物质的特征在于由三种主要聚合物：纤维素、半纤维素和木质素构成的复杂结构，纤维素、半纤维素和木质素的比例随木质纤维素生物质的类型变化而变化。一种典型的但非限制性的组成如下：纤维素以35%至50%的量存在，半纤维素，其是基本上由戊糖和己糖构成的多糖，以20%至30%的量存在，和木质素以15重量%至25重量%的量存在。已证实生物质的降解很困难，因为植物壁的多糖（纤维素和半纤维素）与木质素紧密地结合，这为壁提供了硬度。在这三种聚合物中，纤维素是主要的糖源，因为其由葡萄糖构成；葡萄糖容易改质。通常，通过生物化学途径改质生物质的方法包括多个步骤。第一步骤是收集和输送木质纤维素生物质至生物质转化中心。第二步骤是生物质的预处理或预水解，其使得纤维素可接近酶并因此能够产生经预处理的木质纤维素基料。第三步骤，酶法水解，是指由于使用通过微生物产生的纤维素水解酶和半纤维素水解酶的溶液（也称为酶混合物），纤维素转化成葡萄糖。葡萄糖然后可以在发酵的第四步骤中，一般通过酿酒酵母yeastSaccharomycescerevisiae改质成中间产物，例如乙醇，或通过丙酮丁醇梭菌酵母yeastClostridiumacetobutylicum通过发酵改质为丙酮、丁烷、乙醇ABE混合物。然后，第五步骤蒸馏是指可以浓缩所得的分子。葡萄糖也可以改质为生物燃料（氢气、甲烷）。因此，一个关键步骤是酶法水解。在酶法水解步骤中，所述经预处理的木质纤维素基料必须与包含纤维素水解酶和半纤维素水解酶的液体溶液混合。由于目的是获得高浓度糖，所以酶法水解步骤必须以高浓度的经预处理的木质纤维素基料（即以高干物质含量）进行。已经评价出，在酶法水解期间产生8重量%的最小糖浓度（其对应于大约15重量%的干物质含量）时，所述方法是经济上可行的McIntosh,S.,Zhang,Z.,Palmer,J.,Wong,H.,Doherty,W.O.S.,Vancov,T.,2016.Pilot-scalecellulosicethanolproductionusingeucalyptusbiomasspre-treatedbydiluteacidandsteamexplosion.Biofuels,bioproductsandbiorefining104,346-358。在高干物质含量下操作还使得反应器体积降低，和因此该方法的财务和能量成本降低Larsen,J.,OstergaardPetersen,M.,Thirup,L.,WenLi,H.,KroghIversen,F.,2008.TheIBUSprocessoflignocellulosicbioethanolclosetoacommercialreality.Chem.Eng.Technol.31,765-722。然而，能够证实当干物质含量高时，经预处理的木质纤维素基料与含纤维素水解酶和半纤维素水解酶的所述液体溶液的密切混合是困难的。事实上，以高干物质含量开始酶法水解产生混合和均化的特定问题。反应介质非常粘稠，其需要特殊搅拌，这比在反应混合物已变得更液体化时的水解结束时需要的搅拌复杂得多。一般而言，酶法水解可以在不连续或连续反应器中进行。在不连续或间歇式方法中，将全部组分，包括控制pH的物质，在水解开始时放入反应器中。在水解法过程中，不向反应器添加任何物质或不从反应器取出任何物质。在连续方法中，存在输入流和输出流二者，但反应体积保持恒定。在所述方法的另一配置中，其也称为顺序进料或分批进料模式方法，在方法进行期间不从反应器取出任何物质，但在水解期间以顺序方式向反应器逐步添加基料而不取出任何水解产物。已经发现采用这种类型的基料进料，能够克服例如由基料导致的产物产率的抑制的影响。随着反应进行和在反应进行时，混合物逐渐变成液体并能够添加新鲜基料从而提高干物质含量。然后能够达到高基料浓度并有利地为17至30重量%干物质。从现有技术Mondebach,A.A.,Nokel,S.E.,2013.Enzymatichydrolysisofbiomassathigh-solidsloadings–AReview.BiomassandBioenergy56,526-544已知采用连续进料的酶法水解方法。类似地，专利申请US2010330638A描述了在酶法水解步骤的分批进料模式的供料，表明测试能够测定可以添加至各批次的生物质的量。因此，在每次改变基料类型时，需要在酶法水解步骤之前进行测试。申请WO2016062646描述了一种由木质纤维素材料制备糖和或发酵产物的方法，其包括多个酶法水解步骤，第一步是分批进料模式。专利申请US20100255554描述了一种以分批进料模式水解木质纤维素生物质的方法，其中通过控制反应器体积和或添加经预处理的木质纤维素生物质进料（和任选地酶添加）的频率和在反应器中产生的糖的体积和或浓度调节该方法的功能参数。具体地，所述经预处理的木质纤维素生物质进料总是以相同的频率添加至反应器。申请人已经开发了一种采用顺序进料（分批进料）的改进的酶法水解方法，其能够获得高产率的葡萄糖同时降低该方法的能量消耗和混合时间。更具体地，本发明涉及一种酶法水解的顺序进料方法，其中在搅拌下，使至少一种经预处理的木质纤维素基料在反应器中与水和酶接触，所述方法的特征在于经预处理的木质纤维素基料顺序添加至反应器以随时间逐渐延长的方式进行，从而获得预定的最终干物质含量。当将经预处理的木质纤维素基料，和优选酶，以随时间逐渐延长的顺序进料（分批进料）注入酶法水解方法中时，相比于其中以恒定的时间间隔添加基料的分批进料模式，观察到葡萄糖产率的提高和能量消耗的降低。此外，当以同样的方式添加酶时，即顺序地和随时间延长，并优选与基料同时，注意到对葡萄糖产率的协同效应，其在水解开始时添加全部酶时未见到。本发明的一个优点是其提供一种提高葡萄糖产率的酶法水解方法。本发明的另一个优点为其提供一种由于分批进料技术（但其随时间延长）而通常较少见到混合和粘度问题（如果存在的话）的酶法水解方法。事实上，由于干物质含量逐步增加，对于每次基料添加，容易进行混合，使得一方面由搅拌器消耗的能量降低和或使用不那么复杂的搅拌器（例如倾斜叶片式叶轮或船用叶轮）。此外，本发明的一个进一步的优点是提供一种搅拌器旋转速度低的酶法水解方法，其对于保持酶活性很重要MhlongoSI,HaanR,Viljoen-BloomM,ZylWH.Lignocellulosichydrolysateinhibitorsselectivelyinhibitdeactivatecellulaseperformance2015.EnzymeandMicrobialTechnology,81:16–22。此外，在同一反应器中同时处理（共处理）多种不同类型的基料时，根据本发明的方法是适当的。本发明的另一优点为其提供一种能够监控反应介质变化并对其简单适应而不需要复杂测量的酶法水解方法。根据一个变体，干物质的最终含量高于12重量%，并优选为18至24重量%。根据一个变体，将酶添加至反应器顺序地并随时间逐渐延长地进行。根据一个变体，将经预处理的木质纤维素基料与酶同时添加至反应器。根据一个变体，对于每次添加，经预处理的木质纤维素基料以相同的量添加。根据一个变体，对于每次添加，酶以相同的量添加。根据一个变体，反应器包括搅拌器，且搅拌器直径与反应器直径的比率D:T为0.3至0.75。根据一个变体，搅拌器为倾斜叶片式叶轮或船用叶轮。根据一个变体，酶以0.1至60mg酶g纤维素的浓度接触。根据一个变体，所述方法在40至60℃的温度，4至6的pH和大气压力下进行。根据一个变体，使用各种经预处理的木质纤维素基料本身或其混合物。根据一个变体，在所述方法之后进行在生产醇的微生物的存在下的发酵步骤。根据另一变体，所述方法根据称为SSF方法的同时糖化和发酵的方法在生产醇的微生物存在下进行。发明内容由木质的（落叶性和树脂质（resinous））未加工的或经处理的农业副产品例如稻草、植物纤维、林业作物、生产醇-、糖和谷物的植物残渣、来自造纸厂的残渣、海洋生物质（例如大型藻类纤维质残渣）或木质纤维素材料转化产品获得经预处理的木质纤维素生物质。所使用的木质纤维素生物质优选为木材、麦秸、木浆、芒属植物、稻草或玉米秸秆。根据本发明的方法，可以使用各种类型的木质纤维素生物质本身或其混合物。本发明方法中使用的木质纤维素基料为在允许通过改变木质纤维素材料的物理和理化性质而重构木质纤维素的条件下预处理生物质的结果。可以使用本领域技术人员已知的任何类型的木质纤维素生物质的预处理进行预处理步骤。也可以进行预调理步骤，例如包括压碎或除石。所述预处理步骤可以包括热、化学、机械和或酶处理或这些处理的组合。根据一个优选的变体，所述预处理步骤选自在酸性条件下的预处理，例如在酸性条件下的酸蒸煮或蒸汽爆破、在碱性介质中的预处理，例如采用硫化钠的预处理（Kraft方法）、氨循环渗滤法ARP或氨纤维爆破法AFEX、氧化预处理，例如采用臭氧、过氧化氢、氧气或过乙酸的预处理、不添加化学试剂的预处理，例如不添加酸的蒸汽爆破或通过采用极热水洗涤的预处理、或有机溶剂法。所述预处理步骤有利地是通过在酸性条件下蒸汽爆破进行的预处理。在150至250℃的优化条件下进行几分钟。本发明涉及一种酶法水解的顺序进料方法，其中在搅拌下，使经预处理的木质纤维素基料在反应器中与水和酶接触，所述方法的特征在于向反应器顺序添加经预处理的木质纤维素基料以随时间逐渐延长的方式进行，从而获得预定的最终干物质含量。所述预定的最终干物质含量优选高于12重量%，优选15至30重量%，最优选18至24重量%。在其余的内容中，经预处理的木质纤维素基料的浓度表示为干物质的重量百分比。根据标准ASTME1756-082015“StandardTestMethodforDeterminationofTotalSolidsinBiomass”测量干物质含量。在第一次添加经预处理的木质纤维素基料时，在水解方法开始时的干物质含量一般低于10重量%，优选低于8重量%，特别优选低于6重量%。添加经预处理的木质纤维素基料的频率逐渐延长。因此，“随时间逐渐延长”的添加是指采用降低的频率或换言之采用增加的周期进行添加。因此，第n次和第n+1次添加之间的时间流逝小于第n+1次添加和第n+2次添加之间的时间流逝，以此类推。例如第一次和第二次添加基料之间的时间流逝小于第二次和第三次添加之间的时间流逝，以此类推。例如，第一次添加可以在1小时之后发生，第二次添加可以在3小时之后发生，第三次添加可以在6小时之后发生，第四次添加可以在13小时之后发生和第五次添加可以在24小时之后发生。为了达到预定的最终干物质含量，一般而言，以逐渐延长方式，进行至少三次基料添加，优选至少四次基料添加，更优选至少五次基料添加。在添加经预处理的木质纤维素基料时添加的量一般表示最多5重量%，优选2至5重量%和更优选2至3重量%的干物质含量的增加。在添加时添加的基料的量表示例如3重量%的干物质含量。根据一个变体，所述经预处理的木质纤维素基料在每次添加时以相等的量加入。根据一个优选的变体，向反应器添加酶顺序地和随时间逐渐延长地进行。已经观察到以延长、分批进料模式添加酶使得随时间维持酶活性，这与在酶法水解开始时添加全部酶不同。所述经预处理的木质纤维素基料和酶可以同时或交错添加至反应器，同时随时间逐渐延长地继续顺序添加各组分。所述经预处理的木质纤维素基料和酶优选同时添加至反应器。根据一个变体，酶在每次添加时以相等的量加入。在添加时加入的量一般为0.1至60mg酶g纤维素，优选5至40mg酶g纤维素，最优选10至30mg酶g纤维素。所述酶法水解一般在4至6，优选4.5至5.8，更优选4.8至5.5的pH下进行。其一般在40至60℃，优选45至55℃的温度下进行。其有利地在大气压力下进行。所述酶法水解借助由微生物产生的酶进行。所添加的酶溶液包含将纤维素分解成糖的酶。微生物，例如木霉属、曲霉属、青霉属或裂褶菌属的真菌，或厌氧细菌，例如梭菌属的厌氧细菌，产生这些酶，其特别含有适合纤维素大量水解的纤维素酶。以高度优选的方式，步骤d）的纤维素水解酶通过微生物里氏木霉Trichodermareesei产生。根据本发明，酶法水解时的接触时间为5至200小时，优选2至100小时，最优选1至50小时。根据本发明的所述方法可以通过随时间测量反应介质的一个流变学特性的值而监控，所述流变学特性有利地选自反应介质粘度、搅拌系统轴的扭矩和电机所消耗的电功率。电机所消耗的电功率具有符号P电。在本发明的方法期间，即在液化期间，反应介质的粘度、搅拌系统轴的扭矩和电机所消耗的电功率为从多个方面对监控所产生的木质纤维素基料有用的流变学特性。事实上，粘度、扭矩和功率的这些特性是互相关联的。电机所消耗的电功率P电与驱动搅拌器轴的机械功率P机械相关联。电机所消耗的电功率为在中试或工业生产设备中常规测量和监控的参数。下式定义了各种参数之间的关系：P机械=fP电，f为由电机构造方说明的电机设计特性。P机械=2πN*C，其中：N为以每秒转数计的搅拌速度，C为以N.m计的扭矩，和P机械为以瓦特计的功率。在搅拌期间，以下关系适用：P机械=ρNpN3D5ρ为以kg.m-3计的反应介质的密度，D为以m计的搅拌器的直径，Np为搅拌器的特性，其取决于槽的几何结构和流型。在层流流型期间，以下关系适用：Np=ARe，因此P机械=ρAN3D5Re其中A为搅拌系统常数，Re为雷诺数，其中Re=ρND2,为以帕斯卡秒Pa.s计测量的反应介质的平均动态粘度，其中=P机械AN2D3=2πCAD3N。尽管粘度和搅拌系统轴的扭矩为以小规模容易获得的量度，但电机所消耗的电功率P电为在工业规模上最容易测量的量级。以高度优选的方式，根据本发明的所述方法的特征在于对电机所消耗的电功率随时间进行测量。根据本发明的所述方法有利地在反应器中进行，所述反应器优选具有圆柱形，高度直径比有利地为1至3。由于逐渐延长的分批进料模式，反应介质中粘度的影响没那么显著。常规地，所选的搅拌器必须能够处理层流。然后，宽搅拌器，或甚至在中等旋转速度下刮划反应器壁和施加共混和捏合作用的那些是必要的。在根据本发明的方法中，可以使用倾斜叶片式叶轮或船用叶轮型的较简单的搅拌器。具体地，在根据本发明的方法中可以使用具有较小直径的搅拌器。根据一个变体，搅拌器直径反应器直径比率DT有利地为0.3至0.75，优选0.4至0.65。类似地，旋转速度可以低于常规系统。旋转速度一般低于100rpm（每分钟转数），优选低于80rpm。根据一个优选的实施方案，根据本发明的酶法水解方法之后可以进行通过生产醇的微生物进行的醇法发酵步骤从而产生含醇的发酵流出物。所述酶法水解和醇法发酵也可以同时进行。在本文中其为同时糖化和发酵或SSF方法的情况。也可以根据本领域技术人员已知的其他布置进行酶法水解和醇法发酵，例如预糖化之后进行同时糖化和发酵方法PSSF或混杂水解和发酵方法HHF。通过酶法水解获得的糖可以发酵成醇，例如乙醇、1,3-丙二醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇或1,4-丁二醇本身或其混合物。所述醇法发酵优选产生乙醇。通过酵母或其他生产醇的微生物确保醇法发酵。在本发明的含义中，术语“醇法发酵”是指糖只通过微生物发酵成一种或多种醇的方法。在己糖的醇法发酵步骤中使用的生产醇的微生物优选选自酵母和细菌，其可以是转基因的。当生产醇的微生物为酵母时，酿酒酵母是最有效的。也可以选择酵母例如粟酒裂殖酵母Schizosaccharomycespombe或葡萄汁酵母Saccharomycesuvarum或糖化酵母diastaticus。更嗜热的酵母，例如脆壁克鲁维酵母Kluyveromycesfragilis（现在通常称为K.marxianus）也是有利的，尤其是在酶法水解和醇法发酵同时进行SSF方法时。还可以使用转基因生物，例如酿酒酵母型酵母例如TMB3400Ohgren等人,J.ofBiotech126,488-498,2006。当生产醇的微生物为细菌时，优选的是例如运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis，其提供生产乙醇的同化的有效途径，或梭菌属的厌氧细菌，例如用于生产醇和溶剂的混合物例如丙酮-丁醇-乙醇ABE或异丙醇-丁醇-乙醇IBE的丙酮丁醇梭菌，或用于生产异丁醇的大肠杆菌。醇法发酵优选在30℃至40℃的温度下在3至6.5的pH下进行。酵母，优选酿酒酵母为所使用的高度优选的微生物。它们具有更大的稳健性和安全性，并且不需要操作所述方法和设备的无菌条件。酵母属的酵母能够仅发酵己糖（基本上为葡萄糖和甘露糖）。这些酵母以优化方式将己糖改质成乙醇并能够获得良好的转化率。当在相同的操作中进行酶法水解和醇法发酵SSF方法时，温度优选为30至45℃，pH为4至6，从而刺激酵母性能。下文的操作实施例意欲举例说明本发明。具体实施方式通过以逐渐延长方式顺序进料（分批进料）进行具有高干物质DM含量的经预处理的麦秸的酶法水解方法。与常规分批进料策略（其以规律的时间间隔添加）不同，这种新策略由以随时间逐渐延长而添加的方式顺序增加干物质含量构成。图1a和2a示出根据常规的分批进料技术的添加，而图1b和2b示出根据随时间逐渐延长的分批进料技术的添加。图2跨时间坐标放大了图1的细节。在测试开始时向反应器载入足以实现5重量%干物质浓度的全部水含量1.3kg和第一次添加的经预处理的麦秸基料250g。然后，在1、3、6、13和24小时之后进行170g木质纤维素基质的五次等同的添加以实现20重量%的干物质（图1b和2b）。以同样的方式进行酶的添加。采用这个策略，在不超出临界粘度值的情况下，基料颗粒的逐渐液化是可能的，因为这不允许采用倾斜叶片式或船用叶轮的充分混合。根据本发明的方法允许实现80至85%的葡萄糖产率，其中经48h的酶法水解具有35-40kJ的低能量消耗。具体地，通过本发明方法经48h实现的能量消耗与采用其他分批进料策略只在5h内实现的能量消耗相同。事实上，当纤维素通过纤维素酶转化中存在高活性时，在测试的第一个24小时观察到葡萄糖的指数增长。之后，增长变慢：在前几个小时内，对于混合物中消耗的每kJ记录50至90g的葡萄糖增加；在24小时后，其为10-15gkJ，并且在48h之后，其降到低于10gkJ。类似地，混合系统的旋转速度缓慢（约80rpm）。所述酶为具有通过弱作用力稳定的分子结构的蛋白质。这种弱稳定是指各种参数影响蛋白质。机械应力为能够降低酶活性的因素。随时间逐渐延长的顺序添加的策略还能够适用于酶。图3示出在测试开始时添加全部量的酶（ZE，图3）和伴随顺序添加基料而顺序添加（GE，图3）之间的差别。图3示出如果在酶法水解开始时进料全部量的酶52.8g，则葡萄糖非常快速地增加。然而，这意味着在反应介质中产生葡萄糖过快，其抑制酶并因此抑制葡萄糖产生。相比之下，逐步添加酶（对于每次添加，8.8g，随时间逐渐延长）使得抑制的酶被替代并且在该方法结束时获得较高产量的葡萄糖（图3）。

权利要求：1.酶法水解的顺序进料方法，其中在搅拌下，使至少一种经预处理的木质纤维素基料在反应器中与水和酶接触，所述方法的特征在于向反应器顺序添加经预处理的木质纤维素基料以随时间逐渐延长的方式进行，从而获得预定的最终干物质含量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述最终干物质含量高于12重量%。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述最终干物质含量为18至24重量%。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中向反应器添加酶顺序地并随时间逐渐延长地进行。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述经预处理的木质纤维素基料和酶同时添加至反应器。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中对于每次添加，所述经预处理的木质纤维素基料以相同的量添加。7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中对于每次添加，酶以相同的量添加。8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述反应器包括搅拌器，并且搅拌器的直径与反应器的直径的比率D:T为0.3至0.75。9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述搅拌器为倾斜叶片式叶轮或船用叶轮。10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述酶以0.1至60mg酶g纤维素的浓度接触。11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述方法在40至60°C的温度下，在4至6的pH下和在大气压力下进行。12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中使用各种经预处理的木质纤维素基料本身或其混合物。13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中所述方法之后进行在生产醇的微生物的存在下的发酵步骤。14.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中所述方法根据同时糖化和发酵的方法在生产醇的微生物存在下进行。

百度查询： IFP 新能源公司 随时间逐渐延长地添加经预处理的基料的酶法水解的顺序进料方法

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