申请/专利权人：河北科星药业有限公司

申请日：2021-08-10

公开（公告）日：2023-07-18

公开（公告）号：CN113736811B

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;A61K39/108;A61P31/04;C12R1/19

优先权：["20210730 CN 2021108759496"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.07.18#授权;2021.12.21#实质审查的生效;2021.12.03#公开

摘要：本发明公开了一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用，该质粒DNA序列中包括温度敏感血凝素tsh基因、胞膜脂蛋白bor基因和囊泡蛋白yncE基因，其中，tsh基因由温度敏感血凝素转运蛋白tshβ基因和温度敏感血凝素效应蛋白tshs基因组成。该质粒的构建包括目的基因的克隆、yncE基因连接pETDuet‑1质粒、tsh基因和bor基因连接pETDuet‑1质粒及yncE2基因连接pETDuet‑1tshbor质粒等步骤。本发明将上述质粒转化入表达菌株细胞，使目的蛋白共表达，用于制备基因工程菌疫苗的引物特异性强、灵敏度高。本发明的方法能够促进tshs、yncE基因胞外表达高效表达有活性蛋白，所制得疫苗防治效果突出。

主权项：1.一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，它按照如下的步骤依次进行：S1.目的基因的克隆以禽致病性大肠杆菌基因为模板，利用引物分别扩增tsh基因、bor基因和yncE基因，其中，引物序列如下： tsh基因上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’， tsh基因下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’； bor基因上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’， bor基因下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’； yncE基因上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’， yncE基因下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；S2.yncE基因连接pETDuet-1质粒将S1扩增所得的yncE基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE基因并连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1yncE质粒作模板，利用引物扩增yncE2基因；其中，yncE2基因上游引物序列：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’， yncE2基因下游引物序列：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；S3.tsh基因和bor基因连接pETDuet-1质粒将S1扩增所得的tsh基因和bor基因分别连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，分别酶切回收带有酶切位点的tsh基因和bor基因并依次连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1tshbor质粒；S4.yncE2基因连接pETDuet-1tshbor质粒将S2扩增所得的yncE2基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE2基因并连接入pETDuet-1tshbor质粒，经转化，筛选yncE2基因与tsh基因和bor基因序列方向相反的克隆，提取pETDuet-1tshboryncE2质粒，即为促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒。

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