申请/专利权人：贵州中医药大学

申请日：2021-04-14

公开（公告）日：2023-09-12

公开（公告）号：CN113135968B

主分类号：C07H17/07

分类号：C07H17/07;C07H15/04;C07H15/18;C07J63/00;C07J53/00;C07C69/80;C07C49/743;C07C39/11;C07H1/06;C07C45/78;C07C37/68;C07C67/48;A61K31/7048;A61K31/7032;A61K31/7028;A61K31/704;A61K31/235;A61K31/122;A61K31/05;A61P19/02;A61P29/00;A61P19/08

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.12#授权;2021.08.06#实质审查的生效;2021.07.20#公开

摘要：本发明涉及一种小花清风藤叶中的化合物及其制备方法和应用，通过乙醇回流提取，石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，综合采用正向硅胶柱色谱、反相硅胶ODS柱色谱、羟丙基葡聚糖凝胶等色谱和HPLC‑UVELSD高效液相‑紫外‑蒸发光检测联用技术等手段对小花清风藤有效成分进行分离和纯化，该化合物可在制备治疗抗类风湿关节炎药物中的应用。

主权项：1.一种小花清风藤叶中的化合物的制备方法，其特征在于，化合物的结构式如下： 化合物的制备方法为：取小花清风藤叶10～21kg，用8～12倍量的60～80％乙醇回流提取2～4次，每次提取1～3h，合并提取液，减压回收得乙醇提取物，加8～12L蒸馏水溶散后，分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取至有机层接近透明为止，减压回收有机溶剂至浸膏，减压干燥后的干燥品分别为石油醚层、乙酸乙酯层、水饱和正丁醇层；取正丁醇层萃取物260～300g，用甲醇溶解，加入400～500g硅胶利用研钵均匀搅拌研磨，使样品搅拌均匀至完全被吸附，放置低温烘箱中烘干，备用，取硅胶2～6kg用CH2Cl2搅拌后湿法装柱，采用干法上样的方式将样品装入硅胶柱中，后继续用二氯甲烷和甲醇按不同比例的CH2Cl2：CH3OH进行梯度洗脱，洗脱顺序为：10：1、8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、CH3OH进行洗脱，见表1，利用旋转蒸发器将所有馏分分别进行减压浓缩，将其按照不同的洗脱梯度依次命名为A、B、C、D、E、F、G等7段；表1正丁醇层样品硅胶柱洗脱梯度 合瓶时，采用GF-254薄层层析硅胶板，毛细管0.3点板，依次用展开剂比例为1：1、3：1、10:1、20:1的二氯甲烷：甲醇洗脱，显色剂为10％浓硫酸的乙醇溶液，在紫外灯254nm和365nm下观察，然后将显色相近的编号浓缩合瓶；合瓶数据：1-14、15-16、17-20、21-26、27-39、40-45、46-56、57-74、75-80、81-91、92-110、111-123、124-136、137-172、173-178、179-180、181-183、184-190、191-194、195-202、203-221颗粒、222-225、226-264颗粒、265-269、270-278、279-324、325-369、370-404、405-427、428-459、460-490,其中463、466、471、475、477、482单独一瓶、491-501、502-509、510-542、543-565、566-681、682-708、709-742、743-801、802-863、864-899、900-923、924-939、940-979、980-996、997-1018、1019-1093；纯化1：取92-110合瓶数据8～14g,用甲醇超声溶解，称取20～30gC-18反向柱填料ODS倒入研钵中，反复搅拌研磨，使其混合均匀直至完全吸收后备用,称取25～35g反相柱填料ODS，用甲醇浸泡，搅拌均匀后采用湿法装柱法上柱，使其尽量平整,然后平衡柱子，依次采用甲醇：水80：20、60：40、40：60、20：80平衡柱子，每次使用3倍柱体积，平衡结束后采用干法上样法将样品加入柱子中，将样品以甲醇和水进行梯度洗脱，洗脱顺序依次用比例为40：60、60：40、80：20的甲醇：水、纯甲醇洗脱，洗脱数据为下表2：表2反相柱ODS洗脱数据 合瓶数据：采用GF-254薄层层析硅胶板，毛细管0.3点板,展开剂为20：1的乙酸乙酯：甲醇，显色剂为10％浓硫酸的乙醇溶液1、2、3-5、6-7、8-9、10-13、14-15、16-18、17单独分开、19-20、21-22、23-27、28-29、30-31、32-33、34-37、38、39-42、43-46、47-49；展开剂为5：1的乙酸乙酯：甲醇50-56、57-65；纯化2取正丁醇层370-404合瓶数据8～14g，用甲醇超声溶解，称取15～30gC-18反向柱填料ODS倒入研钵中，反复搅拌研磨，使其混合均匀直至完全吸收后备用，称取24～35g反相柱填料ODS，用甲醇浸泡，采用湿法装柱法上柱，然后使用甲醇与水按20％的梯度，从80％等梯度平衡至20％，每次加入3倍柱体积的量，之后采用干法上样的方式将样品加入柱子中，然后再用甲醇与水梯度洗脱，20％甲醇水、40％甲醇水、60％甲醇水、80％甲醇水、100％甲醇，洗脱数据为下表3；表3反相柱ODS洗脱数据 合瓶数据：采用GF-254薄层层析硅胶板，毛细管0.3点板,展开剂为二氯甲烷与甲醇不同比列展开，显色剂为10％浓硫酸的乙醇溶液1-4、5、6-8、9-16、17、18-24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37-38、39-41、42-44、45-52、53、54、55-63、64-65、66-68、69-72；将两根ODS柱子洗脱所得样品分别放入低温烘箱中烘干，烘干后使用纯甲醇超声溶解后过超滤膜备用，设置半制备高效液相流速为3mlmin,最大压力为20～30Mpa，时间700～900min时间，然后将所纯化后的样品点硅胶薄层板，10％硫酸-乙醇显色后在紫外灯下观察是否为单一斑点，若为单一斑点则可将样品过超滤膜后注射入髙液小瓶中，然后进行高效液相检测是否为单一化合物，进一步经核磁共振鉴定化合物结构，在样品6:1C-2编号17中和样品8:1B-2编号57-65中得到，样品6:1半制备高效液相流动相浓度为85％甲醇水洗脱获得化合物1，样品8:1的流动相浓度为94％甲醇水洗脱获得化合物2和化合物3，样品10:1A-8经半制备高效液相流动相浓度为90％甲醇水洗脱获得14mg的化合物4和17mg的化合物5，样品4:1D1经半制备高效液相流动相浓度为83％甲醇水洗脱获得化合物6,化合物7和化合物8，样品2:1E-2经半制备高效液相流动相浓度为68％甲醇水洗脱获得化合物9和化合物10。

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