申请/专利权人：斯弗因高泰克有限公司

申请日：2017-07-07

公开（公告）日：2023-09-22

公开（公告）号：CN109716136B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/74

优先权：["20160708 EP 16178725.4","20161116 EP 16199092.4"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.22#授权;2019.07.26#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于a诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物。

主权项：1.检测肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的试剂在制备用于充血的诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于：a）诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b）预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c）预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d）评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e）评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，以及其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段选自：根据SEQIDNo.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQIDNo.:2的PAMP或根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQIDNo.:5的ADM-Gly或根据SEQIDNo.:6的CT-proADM。

全文数据：肾上腺髓质素用于评估急性心力衰竭患者的充血本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于：a诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的疗法或干预，或c预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的测量被用作充血的早期替代标记物。心力衰竭HF是一种心脏病症，其在与心脏的结构或功能相关的问题损害它供应充足的血流以满足身体需要的能力时发生。它可以引起大量各种不同的症状，特别是静息时或运动期间呼吸短促SOB、液体潴留的征兆例如肺充血或踝关节肿胀以及静息时心脏的结构或功能异常的客观证据。心力衰竭是一种以由心功能障碍引起的一组症状和征兆为特征的临床综合征。它在发达国家是发病和死亡的主要原因之一，流行率为1-2％。心力衰竭可以被分组成慢性HF和急性HF。患有慢性HF的患者可以被分组成稳定的慢性HF、慢性HF的逐渐恶化的征兆和症状以及慢性HF的急性失代偿。急性心力衰竭AHF被定义为心力衰竭的征兆和症状的快速发作，导致需要紧急治疗或住院治疗。AHF可以表现为急性初发HF在以前没有心功能障碍的患者中新发作的AHF或慢性HF的急性失代偿。在年龄超过65岁的成年人中，AHF是住院治疗的主导原因。尽管在过去几十年中主要与治疗进步相关，慢性心力衰竭患者的预后显著改进，但一旦患者因失代偿性心力衰竭而住院治疗，短期和长期结果两者仍非常不良。接近25％的因AHF而住院治疗的患者在出院的30天内需要重新住院，而10cm-然后将对这三个参数中每一个的评分相加，获得在0至8范围内的复合充血评分。然后使用下述算法对充血严重性分级：CCS＝0，无临床充血CCS1-3，轻度临床充血CCS4-5，中度临床充血CCS≥6，重度临床充血在本发明中示出的另一个实施例BIOSTAT研究的分析中，我们通过外周性水肿水平以严重性逐渐增加的顺序：无，踝，膝下方，膝上方描述了充血等级。尽管PROTECT是在世界范围内选择的具有急性失代偿性心力衰竭、在关于rolofylline与安慰剂相比的效果的随机对照临床试验中登记的患者群体，但BIOSTAT-CHF由具有逐渐恶化的心力衰竭的征兆和或症状的2个欧洲患者组群构成，大约23住院治疗，13在门诊中见到。正如上文解释的，充血可以以许多不同方式分类。本领域技术人员了解，充血程度可以用其他评分或替代物表示。临床分类可以基于床边身体检查，以便检测充血的临床症状征兆如果存在或不存在，分别为“湿”或“干”和或外周低灌注如果存在或不存在，分别为“冷”或“暖”的存在对于综述，参见Ponikowski等，2016.EurHeartJ.ehw128。这些选项的组合鉴定到4个组：暖湿灌注良好并充血——最通常存在的；冷湿低灌注并充血；冷干低灌注并且没有充血；和暖干代偿性，灌注良好并且没有充血。这种分类可能有助于在初始阶段指导疗法并带有预后信息。通常，AHF的症状和征兆反映出流体超载肺充血和或外周性水肿或在较少情况下心输出量降低并伴有外周低灌注。胸部X-射线可能是用于AHF诊断的有用测试。肺静脉充血、胸腔积液、间隙或肺泡水肿和心脏肥大是AHF的最特异性的发现，尽管在高达20％的患有AHF的患者中胸部X-射线是几乎正常的。充血左侧的症状征兆被定义为端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难、肺罗音双侧、外周性水肿双侧。充血右侧的症状征兆被定义为颈静脉扩张、外周性水肿双侧、充血性肝肿大、肝颈静脉回流、腹水、肠充血的症状对于综述，参见Ponikowski等，2016.EurHeartJ.ehw128中的表12.2。水肿是流体在细胞间组织中的积累，其由间隙流体容积的异常扩大引起。间隙与血管内空间之间的流体受到跨过毛细血管的毛细血管静水压梯度和胶体渗透压梯度调控Trayes等，2013.AmFamPhysician882:102-110。当局部或系统性病症破坏这种平衡，导致毛细血管静水压升高、血浆容积增加、血浆胶体渗透压降低低白蛋白血症、毛细血管渗透性提高或淋巴管阻塞时，发生流体的积累。在临床上，水肿表现为肿胀：间隙液的量由体液稳态的平衡决定，流体向间隙的分泌增加或流体移除受损可以引起水肿。在心力衰竭中出现静水压升高。对整个身体通用的水肿原因可以引起多个器官和外周中的水肿。例如，严重心力衰竭可以引起肺水肿、胸腔积液、腹水和外周性水肿。肺水肿是流体在肺的空气空间和实质中的积累。它引起气体交换受损并可能造成呼吸衰竭。它由心脏左心室不能从肺循环充分移除血液“心源性肺水肿”或肺实质或肺的血管系统的损伤“非心源性肺水肿”而造成WareandMatthay2005.N.Engl.J.Med.35326:2788–96。治疗聚焦于3个方面：首先改善呼吸功能，其次治疗根本病因，第三避免肺的进一步损伤。肺水肿、特别是急性肺水肿，可以引起致死的呼吸窘迫或由缺氧造成的心搏骤停。它是充血性心力衰竭的主要特点。肺水肿的最主要症状是呼吸困难，但是也可以包括咳血通常可见为粉红色泡沫样痰、多汗、焦虑和皮肤苍白。呼吸短促可以表现为端坐呼吸由于无法呼吸不能平躺和或阵发性夜间呼吸困难在夜间爆发突然的严重的呼吸困难。这些是由左心室衰竭造成的慢性肺水肿的常见症状。肺水肿的发生可能伴有“流体超载”的症状和征兆；这是一种用于描述左心室衰竭在身体其余部分上的表象的非特异性术语，并包括外周性水肿腿的肿胀，通常为“按压后凹陷”类型，其中皮肤在被按压后缓慢回复正常、颈静脉压升高和肝肿大，其中肝脏膨大并可能柔软或甚至脉动。其他征兆包括听诊时末端吸气裂音在深呼吸结束时听到的声音和第三心音的存在。在本发明中，证实了肾上腺髓质素前体或其片段与充血的严重性和水肿程度相关，预测充血的减轻和施用的利尿剂剂量。在本发明的一个方面，充血残留被定义为到第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。在本发明的一个方面，充血减轻单独或组合地通过下述三种当前现有技术的标记物中的任一者来定义：●利尿剂响应：被定义为到第4天为止每40mg利尿剂剂量的体重减轻。●血液浓缩：编码为0如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平降低或不变的话或1如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平提高的话。●显著的充血残留：被定义为第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。本发明的主题内容是一种方法，所述方法用于：a诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e评估对象的出院决定，其中所述对象是患有急性心力衰竭的对象和或患有心力衰竭并表现出逐渐恶化的征兆的对象和或具有心力衰竭或急性心力衰竭的症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，所述方法包括：●使用至少一种结合剂确定从所述对象获得的体液中免疫反应性被分析物的水平，所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域；以及a将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或b将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血的疗法或干预的需求或成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或c将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后对充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或d将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或e将所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自根据SEQIDNo.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQIDNo.:2的PAMP或根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2或根据SEQIDNo.:5的ADM-Gly或根据SEQIDNo.:6的CT-proADM。从实施例可以看出，肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2的基线水平，独立地预测了到例如第7天为止的显著的充血残留、到例如第4天为止的利尿剂响应和到例如第4天为止的血液浓缩。只有非常少的基线临床变量或生物标志物与基线时的充血严重性相关，并且肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2似乎到目前为止是最强的。肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2与基线时临床充血的严重性强烈相关，并独立地预测了到例如第7天为止显著的充血残留的存在。所述数据强烈地支持下述见解，即肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2是充血的可靠、定量和早期替代物。考虑到对用于评估AHF患者的充血、特别是确定出院前充血残留的存在的准确且可靠的工具存在巨大的尚未满足的需求，这是非常有吸引力的发现。根据本发明，这种肾上腺髓质素前体或其片段、特别是根据SEQIDNo.:4的ADM-NH2可用于确定出院前充血残留的存在。本发明的主题内容是一种方法，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。本发明的主题内容是一种方法，其中所述对象被分层为：a充血等级的组，或b对充血的疗法或干预的无应答者和或应答者和或不良应答者，或c在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。本发明的主题内容是一种方法，其中所述对象被分层为不同患者组，其中一组包含需要疗法的患者，另一组包含不需要疗法的患者。以前，除了其他标志物之外，标志物BNP和proBNP被当作充血标志物。令人吃惊的是，本发明的生物标志物肾上腺髓质素前体或相应的片段远远优于到目前为止被用作充血标志物的任何其他临床或生物化学参数。这已被例如Kremer等，EuropeanJournalofHeartFailure201719SupplS15-601显示，Kremer等人研究了一种代表生物活性肾上腺髓质素的生物标志物bio-ADM作为ADHF中充血的潜在标志物的潜在作用，并评估了在临床评估的充血上增添的预后价值。在1562位因ADHF入院的患者中，在基线、第2天和第7天评估了Bio-ADM。临床充血使用涵盖水肿、端坐呼吸和颈静脉扩张的复合临床充血评分CCS来评价。将它与其他临床和生物化学参数包括BNP进行比较。在大量临床和生物化学参数中，bio-ADM是临床评估的充血的最强预测物。基线bio-ADM水平而不是BNP水平，强烈且独立地与到第7天为止显著的充血残留的存在相关。在到第7天为止具有充血残留的患者中，bio-ADM水平仍然高，而BNP水平降低。在临床评估的充血之上，Bio-ADM而不是BNP，是60天心力衰竭重新住院治疗的强烈的独立预测物。因此，作者得出结论，Bio-ADM在患有ADHF的患者中升高，并且在因ADHF入院的患者中是有希望的残留充血的标志物。Bio-ADM是在出院后不久重新住院治疗的强烈且独立的预测物。在本发明的特定实施方式中，所述proADM和或其具有至少5个氨基酸的片段选自：SEQIDNo.1proADM：164个氨基酸preproADM的22–185ARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFLSEQIDNo.2肾上腺髓质素前体N-20末端肽，PAMP：preproADM的22–41位氨基酸ARLDVASEFRKKWNKWALSRSEQIDNo.3肾上腺髓质素前体中段肽，MR-proADM：preproADM的45–92位氨基酸ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVSEQIDNo.4成熟肾上腺髓质素成熟ADM；酰胺化ADM；bio-ADM；hADM：95–146位氨基酸-CONH2YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH2SEQIDNo.5肾上腺髓质素1-52-GlyADM1-52-Gly：preproADM的95–147位氨基酸YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGSEQIDNo.6C-端肾上腺髓质素前体，CT-proADM：preproADM的148–185位氨基酸RRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL在本发明的特定实施方式中，所述proADM和或其具有至少5个氨基酸的片段选自成熟ADM-NH2SEQIDNo.4、ADM1-52-GlySEQIDNo.5、MR-proADMSEQIDNo.3和CT-proADMSEQIDNo.6。在本发明的特定实施方式中，成熟ADM-NH2SEQIDNo.4和或ADM1-52-GlySEQIDNo.5的免疫反应性水平或MR-proADMSEQIDNo.3的免疫反应性水平或CT-proADMSEQIDNo.6的免疫反应性水平被确定，并与所述患者对疗法或干预的需求相关联，其中如果在所述对象的体液中成熟ADM-NH2SEQIDNo.4和或ADM1-52-GlySEQIDNo.5的免疫反应性水平或MR-proADMSEQIDNo.3的免疫反应性水平或CT-proADMSEQIDNo.6的免疫反应性水平高于阈值，则所述患者被鉴定为具有这种需求。在本发明的特定实施方式中，proADM和或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在成熟ADM-NH2SEQIDNo.4和或ADM1-52-GlySEQIDNo.5的下述序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在成熟ADM-NH2SEQIDNO.4和或ADM1-52-GlySEQIDNo.5的序列内的区域的第二种结合剂。在本发明的特定实施方式中，proADM和或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在MR-proADMSEQIDNo.3的序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在MR-proADMSEQIDNo.3的序列内的区域的第二种结合剂。在本发明的特定实施方式中，pro-ADM和或其片段的水平通过使用选自下述的至少一种结合剂来确定：结合到包含在CT-proADMSEQIDNo.6的序列内的区域的结合剂，以及结合到包含在CT-proADMSEQIDNo.6的序列内的区域的第二种结合剂。在本发明的特定实施方式中，主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述片段可以选自根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的成熟ADM-NH2。本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用针对肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定。本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。在一个特定实施方式中，根据本发明的体液是血液样品。血液样品可以选自全血、血清和血浆。在本发明的特定实施方式中，所述样品选自人类柠檬酸化血浆、肝素血浆和EDTA血浆。本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一位患者中进行一次以上。本发明的主题内容是一种方法，其中所述样品在入院时或出院前获取。本发明的主题内容是一种符合本发明的方法，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和或治疗性措施的响应。本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中使用所述方法以便将所述对象分层为不同充血等级的组。本发明的主题内容是一种根据本发明的方法，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与患有急性心力衰竭或心力衰竭的对象中死亡或不利事件的风险相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定proADM和或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的成熟ADM-NH2，并且70pgmL，没有用利尿剂治疗真1：bio-ADM70pgmL，用利尿剂治疗图4：具有显著充血的患者CCS＝3与没有或具有轻度充血的患者CCS95％。亲和常数为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和性，使用Biacore2000系统GEHealthcareEuropeGmbH,Freiburg,Germany，利用无标记物表面等离子体共振来确定肾上腺髓质素结合到固定化抗体的动力学。使用按照制造商的说明书小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体，进行抗体的可逆固定化。标记程序示踪剂将100μg100μl抗体1mgml，在PBS中，pH7.4与10μl吖啶NHS-酯1mgml，在乙腈中，InVentGmbH,Germany混合EP0353971，并在室温温浴20min。标记的CT-H通过凝胶过滤HPLC在SEC400-5Bio-RadLaboratories,Inc.,USA上纯化。将所述纯化的标记的抗体在300mmolL磷酸钾，100mmolLNaCl，10mmolLNa-EDTA，5gL牛血清白蛋白，pH7.0中稀释。终浓度为每200μL大约800.000相对光单位RLU的标记的化合物约20ng标记的抗体。吖啶酯化学发光使用AutoLumatLB953BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG来测量。固相将聚苯乙烯管GreinerBio-OneInternationalAG,Austria用抗体1.5μg抗体0.3mL100mmolLNaCl，50mmolLTRISHCl，pH7.8包被在室温下18h。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将所述管用pH7.4的PBS清洗并真空干燥。校准物将合成的人类ADMhADMBachem,Switzerland用50mMTrisHCl，250mMNaCl，0.2％TritonX-100，0.5％BSA，20片L完全蛋白酶抑制剂混合物片剂RocheAG，pH7.8，线性稀释。校准物在使用之前储存在-20℃下。实施例2产生高信噪比的抗体组合的确定ADM免疫测定法将50μl样品或校准物吸取到包被的管中，在添加标记的第二抗体200μl后，将管在室温下温浴2h。通过用清洗溶液20mMPBS，pH7.4，0.1％TritonX-100清洗5次每次1ml除去未结合的示踪剂。管结合的化学发光使用LB953BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG来测量。所有抗体在夹心免疫测定法中作为包被的管和标记的抗体使用，并以下述变化形式组合参见表2。温浴按照hADM免疫测定法下所述来进行。结果以特异性信号在10ngmlADM下背景信号不含ADM的样品的比率给出。表2：信噪比NT-ADM示踪剂MR-ADM示踪剂CT-ADM示踪剂NT-ADM195241MR-ADM204904CT-ADM260871令人吃惊的是，我们发现MR-ADM和CT-ADM的组合是具有最高信噪比的组合。随后，我们将这种抗体组合用于进一步调查以测量bio-ADM。我们使用抗MR-ADM抗体作为固相抗体并使用抗CT-ADM抗体作为标记的抗体。典型的剂量信号曲线示出在图1中。所述测定法的分析灵敏度10次运行的平均值，无ADM样品+2SD为2pgADMml。实施例3人类肾上腺髓质素的稳定性将人类ADM在人类柠檬酸血浆中稀释n＝5，终浓度为10ngADMml并在24℃下温浴。在所选的时间点，将等分试样在-20℃下冷冻。在样品融化后，立即使用上述hADM免疫测定法对hADM进行定量。表3示出了在24℃下hADM在人类血浆中的稳定性。令人吃惊的是，在夹心免疫测定法中使用抗体组合MR-ADM和CT-ADM，所述被分析物的分析前稳定性高平均免疫反应性损失仅为0.9％h。相反，使用其他测定方法，报道的血浆半衰期仅为22minHinson等，2000EndocrineReviews212:138-167。由于在医院日常中从取样到分析的时间少于2h，因此所使用的ADM检测方法适用于日常诊断。引人注目的是，不需向样品添加任何非常规添加剂例如抑肽酶Ohta等，1999.ClinChem452:244-251即可达到可接受的ADM免疫反应性稳定性。实施例4校准物制备的可重复性我们发现了为ADM测定法制备校准物的结果的高度可变性平均CV8.5％，参见表4。这可能是由hADM对塑料和玻璃表面的高吸附性造成的Lewis等，1998.ClinicalChemistry443:571-577。通过添加去污剂至多1％TritonX100或1％Tween20、蛋白质至多5％BSA和高离子强度至多1MNaCl或其组合，这种影响仅仅略微减小。令人吃惊的是，如果向校准物稀释缓冲液添加过量的抗ADM抗体10μgml，ADM测定法校准物制备的回收率和可重复性被显著提高到制备间CV10cm-然后将对这三个参数中每一个的评分相加，以获得在0至8范围内的复合充血评分。类似的方案以前被Ambrosy等人使用过Ambrosy等，2013.EuropeanHeartJournal3411:835-843。然后使用下述算法对充血严重性分级：CCS＝0，无临床充血CCS1-3，轻度临床充血CCS4-5，中度临床充血CCS≥6，重度临床充血充血减轻的标志物利尿剂响应：被定义为到第4天为止每40mg利尿剂剂量的体重减轻。血液浓缩：编码为0如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平降低或不变的话或1如果到第4天为止与基线相比存在血红蛋白水平提高的话。显著的充血残留：被定义为第7天为止在JVP、端坐呼吸和水肿评估的基础上CCS≥2。统计分析通过基线时临床充血的严重性概述了基线临床特征和生物标志物包括bio-ADM上面提呈的方案。与基线时临床充血的严重性独立相关的基线因子使用多变量逻辑回归模型来确定CCS变量被记录为具有两种水平的二元结果；0＝轻度中度CCS2**为包括端坐呼吸、JVP、外周性水肿、PCI史、起搏器、ACEIARB使用、BMI、DBP、BUN、血细胞比容和BNP的基线变量进行调整#为基线临床充血评分进行调整NB：在血液浓缩数据中存在～30％的缺失正如对充血的标志物所预期的，bio-ADM浓度越高，用于疗法的利尿剂越多表8和9。表8：根据基线bio-ADM水平的三分位分组的直至第7天或出院如果更早的话的总IV利尿剂剂量；PROTECT表9：基线bio-ADM水平与直至第7天或如果更早的话出院的总IV利尿剂剂量之间的未调整和调整过的关联性；线性回归分析；PROTECT*对年龄、收缩压、肌酐、血尿素氮BUN、白蛋白、钠、HF后住院、基线复合充血评分CCS和BNP进行调整；必须指出，在这个模型中，bio-ADM、基线CCS和肾功能的关联性最强。在同一样品集中，也对MR-proADM进行测定。根据MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表10中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度提高相关。表10：根据MR-proADM的三分位分组的基线特征实施例7BIOSTAT在BIOSTAT研究对慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究进行了另外的分析。所述研究已被详细描述WWW.BIOSTAT-CHF.EU；Voors等，2016.EurJHeartFail.Jun；186:716-26。所述对慢性心力衰竭中定制治疗的生物学研究BIOSTAT-CHF包括来自于11个欧洲国家的2516位具有心力衰竭的逐渐恶化的征兆和或症状的患者，他们被认为经历了次优的医学治疗。来自于苏格兰的另外1738位患者被包含在验证组群中。总的来说，两个患者组群匹配良好。大部分患者因急性心力衰竭而住院治疗，其他人在门诊表现出心力衰竭的逐渐恶化的征兆和或症状。大约一半的患者属于纽约心脏联合会NewYorkHeartAssociationIII类，并且指数和验证组群相比有7％和34％的患者具有射血分数得以保持的心力衰竭。根据研究设计，所有患者均使用利尿剂，但由于两个组群的入选标准，患者没有经历最优的循证医学治疗。在跟进阶段中，鼓励使用高于指南推荐的剂量。研究群体患者满足下述入选标准：●年龄≥18岁，具有新发或逐渐恶化的心力衰竭的症状，●具有由下述指标记载的心功能障碍的客观证据●左心室射血分数≤40％，或●BNP和或N-端脑利尿钠肽前体NT-proBNP的血浆浓度分别400pgmL或2000pgml，●在入选时使用≥40mg天或当量的口服或静脉注射呋塞米治疗，●以前没有用循证治疗[血管紧张素转化酶ACE抑制剂血管紧张素受体拮抗剂ARB和β-阻断剂]或在入选时接受≤50％的这些药物的目标剂量，●治疗医师期望开始使用ACE抑制剂ARB和或β-阻断剂或提高它们的剂量。患者为住院患者或从门诊征召。大约23是住院患者，13在门诊找到。在本发明中分析了包含所述试验中包括的所有患者类型的患者子集n＝1806，所述患者在基线时的生物标志物测量值可用。与PROTECT研究实施例6相似，在BIOSTAT研究中，bio-ADM水平的提高也与水肿严重性的提高相关表11。表11：按照外周性水肿的严重性分组的基线临床变量和标准的生物标志物；BIOSTAT在同样的样品集中也测定了MR-proADM。按照MR-proADM的三分位分组的基线特征示出在表12中：与bio-ADM相似，MR-proADM水平的提高与水肿程度提高相关。表12：按照MR-proADM的三分位分组的基线特征实施例8PROTECT子群分析表13示出了PROTECT试验的根据左心室射血分数LVEF状态分组的关于bio-ADM水平与临床充血之间的关联的数据。由于基于射血分数的分类是当前在心力衰竭中使用的最相关的表型分型，因此将HFrEF与HFpEF子群相比进行了分析。在两个子群中bio-ADM水平与临床充血评分之间的关联是可比的。表13：在PROTECT中根据射血分数状态分组的基线bio-ADM水平对数变换的与临床充血评分之间的关联性1＝对于结果1来说对BMI、血清白蛋白和HF后住院进行调整2＝对于结果2来说对包括端坐呼吸、JVP、外周性水肿、PCI史、起搏器、ACEIARB使用、BMI、舒张压、血尿素氮、血细胞比容和BNP的基线变量进行调整*在对数变换的bio-ADM与作为连续变量被包含的左心室射血分数LVEF之间测试的相互作用伴有射血分数降低的心力衰竭HFrEF被定义为LVEF2d.f.PBio-ADM因子+高阶因子87.7126cm的存在各自为评分添加1点，参见表21。在临床充血评分CCS为3的患者中Bio-ADM升高n＝284，p1的患者中p＝0.05bio-ADM结果更高，表明bio-ADM在检测充血中的潜在作用，而其被认为是心力衰竭患者死亡和重新住院治疗的主要原因。此外，较高水平的bio-ADM与呋塞米治疗的增加和更高的医院中死亡的比率相关，这可能与充血的量相关分别为p＝0.002和p6cm的存在各自为评分添加1点。在临床充血评分CCS为3的患者中Bio-ADM升高n＝30，psphingotecGmbHADRENOMEDULLINFORASSESSINGCONGESTIONINASUBJECTWITHACUTEHEARTFAILURES75092WO16178725.42016-07-0816199092.42016-11-166PatentInversion3.51164PRTHomosapiens1AlaArgLeuAspValAlaSerGluPheArgLysLysTrpAsnLysTrp151015AlaLeuSerArgGlyLysArgGluLeuArgMetSerSerSerTyrPro202530ThrGlyLeuAlaAspValLysAlaGlyProAlaGlnThrLeuIleArg354045ProGlnAspMetLysGlyAlaSerArgSerProGluAspSerSerPro505560AspAlaAlaArgIleArgValLysArgTyrArgGlnSerMetAsnAsn65707580PheGlnGlyLeuArgSerPheGlyCysArgPheGlyThrCysThrVal859095GlnLysLeuAlaHisGlnIleTyrGlnPheThrAspLysAspLysAsp100105110AsnValAlaProArgSerLysIleSerProGlnGlyTyrGlyArgArg115120125ArgArgArgSerLeuProGluAlaGlyProGlyArgThrLeuValSer130135140SerLysProGlnAlaHisGlyAlaProAlaProProSerGlySerAla145150155160ProHisPheLeu220PRTHomosapiens2AlaArgLeuAspValAlaSerGluPheArgLysLysTrpAsnLysTrp151015AlaLeuSerArg20348PRTHomosapiens3GluLeuArgMetSerSerSerTyrProThrGlyLeuAlaAspValLys151015AlaGlyProAlaGlnThrLeuIleArgProGlnAspMetLysGlyAla202530SerArgSerProGluAspSerSerProAspAlaAlaArgIleArgVal354045452PRTHomosapiens4TyrArgGlnSerMetAsnAsnPheGlnGlyLeuArgSerPheGlyCys151015ArgPheGlyThrCysThrValGlnLysLeuAlaHisGlnIleTyrGln202530PheThrAspLysAspLysAspAsnValAlaProArgSerLysIleSer354045ProGlnGlyTyr-CONH250553PRTHomosapiens5TyrArgGlnSerMetAsnAsnPheGlnGlyLeuArgSerPheGlyCys151015ArgPheGlyThrCysThrValGlnLysLeuAlaHisGlnIleTyrGln202530PheThrAspLysAspLysAspAsnValAlaProArgSerLysIleSer354045ProGlnGlyTyrGly50638PRTHomosapiens6ArgArgArgArgArgSerLeuProGluAlaGlyProGlyArgThrLeu151015ValSerSerLysProGlnAlaHisGlyAlaProAlaProProSerGly202530SerAlaProHisPheLeu35

权利要求：1.一种方法，所述方法用于：a诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，所述方法包括：·确定从所述对象获得的体液中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及a将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或b将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与所述对象的充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或c将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或d将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或e将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自：根据SEQIDNo.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQIDNo.:2的PAMP或根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQIDNo.:5的ADM-Gly或根据SEQIDNo.:6的CT-proADM。2.根据权利要求1的方法，所述方法用于：a诊断对象的充血，或评估或监测对象的充血程度，或b预测或确定或监测对象对充血的疗法或干预的需求，或预测或确定或监测对象的充血的疗法或干预的成功，或指导对象的充血的疗法或干预，或c预测对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或d评估对象在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留，或e评估对象的出院决定，其中所述对象是患有新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF的急性心力衰竭的对象，或者其中所述对象是患有慢性心力衰竭并具有慢性心力衰竭的逐渐恶化的征兆症状的对象，并且其中肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段被用作充血的早期替代标记物，所述方法包括：·使用至少一种结合剂确定从所述对象获得的体液中免疫反应性被分析物的水平，所述结合剂结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列内的区域；以及a将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血程度或诊断充血相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了充血或充血程度，或b将所述免疫反应性被分析物的水平与所述对象的充血的疗法或干预的成功相关联，其中低于一定阈值的水平预测了充血的疗法或干预的成功，并且其中高于一定阈值的水平指示了对充血的疗法或干预的需求，或c将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后对充血的减轻或充血的残留的预测相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平预测了在疗法之后充血的减轻，或d将所述免疫反应性被分析物的水平与在充血的疗法或干预之后充血的减轻或充血的残留相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的残留，而低于一定阈值的水平指示了在充血的疗法或干预之后充血的减轻，或e将所述免疫反应性被分析物的水平与出院决定的评估相关联，其中高于一定阈值的升高的水平意味着所述对象不应该出院，并且其中低于一定阈值的水平意味着所述对象可以出院，其中所述肾上腺髓质素前体或片段选自：根据SEQIDNo.1的肾上腺髓质素前体或根据SEQIDNo.:2的PAMP或根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的成熟ADM-NH2或根据SEQIDNo.:5的ADM-Gly或根据SEQIDNo.:6的CT-proADM。3.根据权利要求1至2任一项的方法，其中所述充血程度被表示为充血评分，特别是临床充血评分。4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述对象被分层为：a充血等级的组，或b对充血的疗法或干预的无应答者和或应答者和或不良应答者，或c在充血的疗法或干预之后具有充血减轻的组或充血残留的组。5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中所述片段可以选自根据SEQIDNo.:3的MR-proADM或根据SEQIDNo.:4的成熟ADM-NH2。6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中通过使用结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来确定肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的水平。7.根据权利要求6的方法，其中所述结合剂选自结合到肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的抗体、抗体片段或非Ig骨架。8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述阈值在阈值范围内，所述阈值范围对于根据SEQIDNo.:4的血浆成熟ADM-NH2来说在50至100pgml之间，对于血浆MR-proADM来说在0.5至1.5nmolL之间，对于血浆CT-proADM来说在85至350pmolL之间。9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中所述肾上腺髓质素前体或其至少5个氨基酸的片段的确定在一位患者中进行一次以上。10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所述样品在入院或出院时获取。11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中进行所述监测以便评估所述对象对采取的预防性和或治疗性措施的响应。12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中所述方法是为了将所述对象分层至充血等级的组。13.根据权利要求1至12任一项的方法，其中将所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平与患有急性心力衰竭的对象的死亡或不利事件的风险相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了死亡或不利事件的提高的风险。14.根据权利要求1至13任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来指导充血的疗法或干预，其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平高于一定阈值则指示进行疗法或干预，并且其中如果所述肾上腺髓质素前体或片段的水平低于一定阈值则指示不进行充血的疗法或干预。15.根据权利要求1至14任一项的方法，其中使用所述肾上腺髓质素前体或其片段的水平或所述免疫反应性被分析物的水平来确定对充血的疗法或干预的需求。16.根据权利要求1至15任一项的方法，其中所述干预或疗法选自利尿剂的给药、强心剂的给药、血管舒张剂的给药、超滤。

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