申请/专利权人：瑞泽恩制药公司

申请日：2017-06-09

公开（公告）日：2023-10-13

公开（公告）号：CN109563170B

主分类号：C07K16/28

分类号：C07K16/28;A61K39/395

优先权：["20160610 US 62/348,353","20161209 US 62/432,023","20170502 US 62/500,312"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.13#授权;2019.07.09#实质审查的生效;2019.04.02#公开

摘要：本申请提供了特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的抗体和其抗原结合片段，以及使用该抗体和抗原结合片段的方法，包括例如使用其的治疗方法。

主权项：1.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：氨基酸序列如SEQIDNO:340所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQIDNO:342所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQIDNO:344所示的HCDR3，氨基酸序列如SEQIDNO:404所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQIDNO:406所示的LCDR2，和氨基酸序列如SEQIDNO:408所示的LCDR3。

全文数据：抗GITR抗体及其用途发明领域本发明涉及特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的抗体和其抗原结合片段以及其使用方法。背景技术糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR是肿瘤坏死因子受体超家族TNFRSF的成员。GITR在调节性T细胞上组成性高表达，在初始T细胞、NK细胞和粒细胞上有较低中等表达，并且在活化后诱导性表达。GITR与其配体GITRL相互作用，GITRL主要在抗原呈递细胞上表达。GITR受体活化可以加强效应T细胞增殖和功能并减弱调节性T细胞诱导的抑制作用。因此，调节GITR活性可以充当癌症免疫疗法和免疫病症的基础。因此，需要调节GITR活性的药剂，例如抗体。发明概述本发明提供了结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体尤其适用于靶向表达GITR的免疫细胞，例如效应T细胞、调节性T细胞和NK细胞。本发明的抗体可以是全长抗体例如IgG1或IgG4抗体或可以仅包括抗原结合部分例如Fab、Fab'2或scFv片段，并且可以经过修饰以影响功能，例如消除残余效应功能Reddy等人,2000,《免疫学杂志J.Immunol.》164:1925-1933。示例性的本发明抗GITR抗体列于本申请表1和2中。表1列出了示例性抗GITR抗体的重链可变区HCVR、轻链可变区LCVR、重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列标识符。表2阐述了示例性抗GITR抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的核酸序列标识符。本发明提供了特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括HCVR，所述HCVR包括选自表1中所列HCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括LCVR，所述LCVR包括选自表1中所列LCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括HCVR和LCVR氨基酸序列对HCVRLCVR，所述HCVRLCVR包括表1中所列的任一个与表1中所列LCVR氨基酸序列中的任一个配对的HCVR氨基酸序列。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列的任一个示例性抗GITR抗体中所包含的HCVRLCVR氨基酸序列对。在某些实施方式中，HCVRLCVR氨基酸序列对选自以下组：98106；162170；194202；242250；290298；338402；以及346402。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括重链CDR1HCDR1，所述HCDR1包括选自表1中所列HCDR1氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括重链CDR2HCDR2，所述HCDR2包括选自表1中所列HCDR2氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括重链CDR3HCDR3，所述HCDR3包括选自表1中所列HCDR3氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链CDR1LCDR1，所述LCDR1包括选自表1中所列LCDR1氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链CDR2LCDR2，所述LCDR2包括选自表1中所列LCDR2氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链CDR3LCDR3，所述LCDR3包括选自表1中所列LCDR3氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括HCDR3和LCDR3氨基酸序列对HCDR3LCDR3，所述HCDR3LCDR3包括表1中所列的任一个与表1中所列LCDR3氨基酸序列中的任一个配对的HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列的任一个示例性抗GITR抗体中所包含的HCDR3LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方式中，HCDR3LCDR3氨基酸序列对选自以下组：104112；168176；200208；248256；296304；344408；以及352408。本发明还提供特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列的任一个示例性抗GITR抗体中所包含的一组六个CDR即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3。在某些实施方式中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自以下组：100-102-104-108-110-112；164-166-168-172-174-176；196-198-200-204-206-208；244-246-248-252-254-256；292-294-296-300-302-304；340-342-344-404-406-408；和348-350-352-404-406-408。在一个相关实施方式中，本发明提供了特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括如由表1中所列的任一个示例性抗GITR抗体中所定义的HCVRLCVR氨基酸序列对内所包含的一组六个CDR即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3。例如，本发明包含特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下组的HCVRLCVR氨基酸序列对内所包含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组：98106；162170；194202；242250；290298；338402；和346102。用于鉴别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域众所周知的并且可以用于鉴别本申请所公开的指定HCVR和或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR边界的示例性惯例包含例如卡巴特定义Kabatdefinition、科西亚定义Chothiadefinition和AbM定义。一般来说，卡巴特定义是基于序列变化，科西亚定义是基于结构环区域的位置，而AbM定义是卡巴特法与科西亚法之间的折中。参见例如Kabat的“免疫相关蛋白质的序列SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”，美国国家卫生研究院NationalInstitutesofHealth，马里兰州贝塞斯达Bethesda,Md.1991；Al-Lazikani等人，《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》273:927-9481997；以及Martin等人，《美国国家科学院院刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA》86:9268-92721989。公共数据库也可用于鉴别抗体内的CDR序列。本发明还提供编码抗GITR抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中所列的任一个HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列HCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列LCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列HCDR1核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列HCDR2核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列HCDR3核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列LCDR1核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列LCDR2核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码表1中所列的任一个LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列LCDR3核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。本发明还提供编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包括一组的三个CDR即，HCDR1-HCDR2-HCDR3，其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中所列的任一个示例性抗GITR抗体所定义。本发明还提供编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包括一组的三个CDR即，LCDR1-LCDR2-LCDR3，其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中所列示的任一个例性抗GITR抗体所定义。本发明还提供编码HCVR和LCVR的核酸分子，其中所述HCVR包括表1中所列HCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包括表1中所列LCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述核酸分子包括选自表2中所列HCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列，以及选自表2中所列LCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。根据本发明这一方面，在某些实施方式中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR来源于表1中所列的同一抗GITR抗体。本发明还提供重组表达载体，所述重组表达载体能够表达包含抗GITR抗体的重链或轻链可变区的多肽。例如，本发明包括含以上提到的核酸分子中的任一个即编码表1中所列的任一个HCVR、LCVR和或CDR序列的核酸分子的重组表达载体。引入了此类载体的宿主细胞也包含于本发明的范围内，同时，产生所述抗体或其部分的方法也包含于本发明的范围内，所述方法是通过在允许产生所述抗体或抗体片段的条件下培养所述宿主细胞并回收由此产生的抗体和抗体片段。本发明包含具有修饰过的糖基化模式的抗GITR抗体。在一些实施方式中，去除不合需要的糖基化位点的修饰可能是有用的，例如，在寡糖链上不存在岩藻糖部分的抗体增强抗体依赖性细胞毒性ADCC增强参见Shield等人2002JBC277:26733。在其它应用中，可以进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性CDC。另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括特异性结合GITR的重组人抗体或其片段和药学上可接受的载剂。在一个相关方面，本发明的特征在于一种组合物，所述组合物是抗GITR抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方式中，所述第二治疗剂是宜与抗GITR抗体组合的任何药剂。本发明还提供抗体-药物偶联物ADC，其包括偶联至细胞毒性剂的抗GITR抗体。包含本发明抗GITR抗体的示例性组合疗法、共调配物和ADC公开于本申请中别处。在又一方面，本发明提供了使用本发明的抗GITR抗体或抗体的抗原结合部分用于杀灭肿瘤细胞、或用于抑制或减缓肿瘤细胞生长、或以其它方式治疗罹患癌症的患者的治疗方法。本发明这一方面的治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括本发明的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的病症是通过靶向GITR和或通过增加T细胞增殖或功能和或抑制由调节性T细胞诱导的抑制活性可改善、缓和、抑制或预防的任何疾病或病况。在又一方面，本发明提供了使用抗GITR抗体或抗GITR抗体的抗原结合部分与抗PD1抗体或抗PD1抗体的抗原结合部分的组合用于杀灭肿瘤细胞、或用于抑制或减缓肿瘤细胞生长、或以其它方式治疗罹患癌症的患者的治疗方法。本发明这一方面的治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括抗GITR和抗PD1抗体或抗原结合片段组合物的组合。所治疗的病症是通过靶向GITR和PD1而可改善、缓和、抑制或预防的任何疾病或病况。根据以下详细说明的评述，其它实施方式将变得显而易见。附图简要说明图1描绘了如实施例7描述的针对肿瘤攻击之后的天数所标绘的各治疗组的平均肿瘤体积mm3±SEM。用同型抗体空心圆，○、抗PD-1抗体空心正方形，□、抗GITR抗体空心锥形，Δ或抗PD-1与抗GITR的组合实心倒置锥形，▼治疗小鼠。图2描绘了如实施例7描述的用抗小鼠GITR和抗小鼠PD1抗体的组合治疗带有MC38小鼠的存活率分析。用同型抗体空心圆，○、抗PD-1抗体空心正方形，□、抗GITR抗体空心锥形，Δ或抗PD-1与抗GITR的组合空心倒置锥形，▽治疗小鼠。图3描绘了如实施例7描述的用MC38或B16.F10.9肿瘤细胞攻击的无肿瘤或未处理对照小鼠的个体肿瘤生长曲线。图4描绘了如实施例7描述的用不同清除型抗体治疗的小鼠的平均肿瘤体积。图5描绘了如实施例7描述的有关肿瘤内CD8Treg、CD4TeffTreg比率的FACS分析结果。图6描绘了如实施例7描述的肿瘤中T细胞亚群的百分含量和每立方毫米肿瘤的细胞数量。图7描绘了如实施例7描述的针对肿瘤攻击之后的天数所标绘的各治疗组的平均肿瘤体积mm3±SEM。图8描绘了如实施例7描述的用抗人GITR抗体和抗小鼠PD1抗体的组合治疗带有MC38的GITRGIRL人源化小鼠的存活率分析。图9描绘了如实施例7描述的肿瘤内和脾CD8T细胞的百分含量、Treg细胞的百分含量和CD8Treg比率的FACS分析。图10描绘了如实施例7描述的针对肿瘤攻击之后的天数所标绘的各治疗组的平均肿瘤体积mm3±SEM。图11描绘了如实施例7描述的用抗小鼠GITR抗体和抗人PD1抗体的组合治疗带有MC38的PD1PDL1人源化小鼠的存活率分析。图12描绘了如实施例7描述的带有MC38的小鼠的肿瘤生长曲线。Y轴表示肿瘤体积，以立方毫米为单位，且X轴表示肿瘤攻击后的时间，以天为单位。空心符号□、○表示先用同型抗体对照治疗的小鼠。实心符号■、●表示先用抗CD226抗体治疗的小鼠。接着用同型抗体治疗的小鼠由圆形○、●和实线表示。接着用抗GITR和抗PD-1组合治疗的小鼠由正方形□、■和虚线表示。图13描绘了如实施例7描述的带有MC38的小鼠的存活率曲线。Y轴表示存活率百分比，且X轴表示肿瘤攻击后的时间，以天为单位。空心符号□、○表示先用同型抗体对照治疗的小鼠。实心符号■、●表示先用抗CD226抗体治疗的小鼠。接着用同型抗体治疗的小鼠由圆形○、●和实线表示。接着用抗GITR和抗PD-1组合治疗的小鼠由正方形□、■和虚线表示。图14描绘了如实施例7描述的用同型IgG治疗的带有MC38的野生型小鼠由菱形[◇◆]表示或TIGIT基因敲除小鼠由三角形[■▲]表示的肿瘤生长曲线。Y轴表示肿瘤体积，以立方毫米为单位，且X轴表示肿瘤攻击后的时间，以天为单位。空心符号和虚线表示先用同型抗体对照治疗的小鼠。实心符号和实线表示先用抗CD226抗体治疗的小鼠。图15描绘了如实施例7描述的用同型IgG治疗的带有MC38的野生型小鼠由圆形[○、●]表示或TIGIT基因敲除小鼠由倒三角形表示的肿瘤生长曲线。Y轴表示肿瘤体积，以立方毫米为单位，且X轴表示肿瘤攻击后的时间，以天为单位。空心符号和虚线表示先用同型抗体对照治疗的小鼠。实心符号和实线表示先用抗CD226抗体治疗的小鼠。图16包含累积分布函数CDF曲线，描绘了在总细胞图A、克隆扩增图B或未扩增图C的CD8+T细胞中由组合治疗引起的CD226表达上调。X轴表示CD226表达量，以log2每百万个映射的读段read中每千碱基转录物长度的读段数ReadsPerKilobaseoftranscriptperMillionmappedreads，RPKM表示，并且Y轴表示累积频率。红线表示抗GITR抗PD1治疗；黑线表示同型抗体治疗；蓝线表示抗GITR治疗；紫线表示抗PD1治疗。图17是蛋白质印迹Westernblot，描绘了磷酸化CD3ζ和磷酸化CD226的相对表达量随PD-1浓度的变化。图18A-18D描绘了在野生型空心条柱和CD226基因敲除小鼠实心条柱中产生的T细胞类型的数量的条形图。图18A条形图描绘了关于胸腺中T细胞发育的FACS分析细胞数量Tconv：常规T细胞；DP：CD4CD8双阳性；SP：单阳性；DN：CD4CD8双阴性。图18B条形图描绘了野生型和CD226--动物的脾和血液中T细胞亚群体的FACS验证细胞数量。图C条形图描绘了表达PD1的脾和血液中的T细胞亚群的FACS分析MFI，平均荧光强度。图D条形图描绘了表达GITR的脾和血液中的T细胞亚群的FACS分析MFI。图18E-18I条形图描绘了用抗CD3+抗CD28Ab离体TCR刺激脾细胞16小时后炎性细胞因子的分泌情况以皮克毫升表示。用抗CD3+抗CD28Ab刺激来自CD226--小鼠实心条柱或野生型WT小鼠空心条柱的脾细胞16小时。图18E＝IFN-γ；图18F＝IL-2；图18G＝TNF-α；图18H＝IL-6；以及图18I＝IL-5。图19线图描绘了动物存活率百分比随肿瘤攻击后的时间以天为单位的变化。图19A描绘了用MC38肿瘤细胞攻击并用抗GITR+抗PD-1Ab实心圆和正方形或同型Ab空心圆和正方形治疗的CD226KO小鼠玫瑰色线或WT同窝幼畜黑线。图19B-19D描绘了抗体治疗对以下动物的影响：B用阻断CD28信号传导的抗体治疗的动物10mgkgCTLA-4-Ig；图19B，绿线；C用阻断OX40信号传导的抗体治疗的动物10mgkgOX40L阻断抗体；图19C；以及D用阻断4-1BB信号传导的抗体治疗的动物10mgkg4-1BBL阻断抗体；图19D。图20线图描绘了用同型空心圆和黑线、抗PD1空心正方形、红线、抗GITR空心正立锥形和绿线和抗GITR抗PD1组合疗法空心倒置锥形和蓝线治疗的小鼠的肿瘤尺寸以立方毫米为单位随肿瘤攻击之后的天数的变化。图20-A表示不表达CD155的MC38肿瘤。图20-B表示表达CD155的MC38肿瘤。图21条形图描绘了用过度表达CD155的MC38肿瘤细胞实心条柱和不表达CD155的MC38肿瘤细胞空心条柱攻击的动物表达CD226图21A、4-1BB图21B和IFN-γ图21C的细胞的数量。图22散点图描绘了癌症患者肿瘤活组织切片的RNA-Seq分析，显示了CD226RNA表达量以log2[RPKM]表示随抗PD-1Ab治疗的变化。发明详述在描述本发明前，应理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因此这些方法和条件可以变化。还应理解，本申请所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不打算作为限制，原因是本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另外定义，否则本申请所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。如本申请所使用，当术语“约”用于所叙述的特定数字值时，意思指该值可与所述值有不超过1％的差异。例如，如本申请所使用，表述“约100”包含99和101以及两者之间的所有值例如99.1、99.2、99.3、99.4等。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本申请所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但本申请描述的为优选的方法和材料。本说明书中提到的所有专利、申请和非专利出版物都以全文引用的方式并入本申请中。定义如本申请所使用的表述“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体”、“GITR”等是指包括如SEQIDNO:413NCBI登录号#NP_004186.1中所列的氨基酸序列的人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体。表述“GITR”包括单体和多聚体GITR分子。如本申请所使用的表述“单体人GITR”意思指不含或具有任何多聚化结构域并且在常规条件下以不与另一GITR分子直接物理连接的单一GITR分子形式存在的GITR蛋白质或其部分。示例性单体GITR分子是包括SEQIDNO:409的氨基酸序列的分子，在本申请中称作“hGITR.mmh”参见例如本申请中的实施例3。如本申请所使用的表述“二聚体人GITR”意思指包括了通过连接子、共价键、非共价键或通过多聚化结构域如抗体Fc结构域彼此连接的两个GITR分子的构建体。示例性二聚体GITR分子包括分别包含SEQIDNO:410和SEQIDNO:411的氨基酸序列的分子，在本申请中称作“hGITR.mFc”和“hGITR.hFc”参见例如本申请中的实施例3。除非明确说明来自非人物种，否则本申请中所有提到的蛋白质、多肽和蛋白质片段意图指相应的人的蛋白质、多肽或蛋白质片段。因此，除非说明是来自非人物种，例如“小鼠GITR”、“猴GITR”等，否则表述“GITR”意思指人GITR。如本申请所使用的表述“细胞表面表达的GITR”意思指在体外或体内于细胞表面上表达的使得GITR蛋白质的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种GITR蛋白质或其细胞外结构域。“细胞表面表达的GITR”可包括在通常表达GITR蛋白质的细胞的表面上表达的GITR蛋白质，或可由该GITR蛋白质组成。或者，“细胞表面表达的GITR”可以包括在表面上通常不表达人GITR但被人工地改造成在表面上表达GITR的细胞的表面上表达的GITR蛋白质，或可由该GITR蛋白质组成。如本申请所使用，表述“抗GITR抗体”包括具有单一特异性的单价和单特异性二价抗体，以及包括结合GITR的第一臂和结合另一靶抗原的第二臂的双特异性抗体，其中抗GITR臂包括如本申请表1中所列的HCVRLCVR或CDR序列中的任一个。表述“抗GITR抗体”还包括含偶联至药物或毒素的即，细胞毒性剂抗GITR抗体或其抗原结合部分的抗体-药物偶联物ADC。表述“抗GITR抗体”还包括含偶联至放射性核素的抗GITR抗体或其抗原结合部分的抗体-放射性核素偶联物ARC。如本申请所使用，术语“抗体”意思指包括至少一个特异性结合至特定抗原例如GITR或与所述特定抗原相互作用的互补决定区CDR的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括含通过二硫键互相连接的四条多肽链，即两条重H链和两条轻L链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体例如IgM。每条重链包括一个重链可变区本申请中缩写为HCVR或VH和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包括一个轻链可变区本申请中缩写为LCVR或VL和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL1。VH和VL区可以进一步细分成高变区，其被称为互补决定区CDR，间杂有更为保守的区域，其称为框架区FR。每个VH和VL是由从氨基末端至羧基末端按以下顺序布置的三个CDR及四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方式中，抗GITR抗体或其抗原结合部分的FR可与人种系序列一致，或可经历天然地或人工地修饰。氨基酸一致序列可基于两个或更多个CDR的并行分析进行定义。如本申请所使用，术语“抗体”还包含全长抗体分子的抗原结合片段。如本申请所使用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”以及类似术语包含特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促获得的、合成的或经遗传改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术如蛋白质水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术从例如全长抗体分子中得到。此类DNA是已知的和或易于从例如商业来源、DNA文库包含例如噬菌体抗体文库得到，或可以合成。可以通过化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA测序和操作，例如以将一个或多个可变和或恒定结构域布置成适当的结构，或以引入密码子、产生半胱氨酸残基、修改、添加或缺失氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实施例包含：iFab片段；iiFab'2片段；iiiFd片段；ivFv片段；v单链FvscFv分子；vidAb片段；和vii由模拟抗体高变区例如分离的互补决定区CDR，如CDR3肽或受限FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单位。其它工程改造过的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等、小模块免疫药物smallmodularimmunopharmaceuticals，SMIP和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本申请所使用的表述“抗原结合片段”内。抗体的抗原结合片段将通常包括至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包括邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列同框的至少一个CDR。在具有VH结构域与VL结构域缔合的抗原结合片段中，VH和VL结构域可相对于彼此以任何适合的布置定位。例如，可变区可以是二聚化的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内找到的可变结构域和恒定结构域的非限制性、示例性的结构包含：iVH-CH1；iiVH-CH2；iiiVH-CH3；ivVH-CH1-CH2；vVH-CH1-CH2-CH3；viVH-CH2-CH3；viiVH-CL；viiiVL-CH1；ixVL-CH2；xVL-CH3；xiVL-CH1-CH2；xiiVL-CH1-CH2-CH3；xiiiVL-CH2-CH3；以及xivVL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何结构中，包含上文所列示例性结构中的任一个，可变结构域和恒定结构域可彼此直接连接，或可通过完全或部分铰链或连接区连接。铰链区可以由至少2个例如5、10、15、20、40、60个或更多个氨基酸组成，这些氨基酸在单一多肽分子中的相邻可变结构域和或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包括同二聚体或异二聚体或其它多聚体，所述二聚体由以上所列的可变结构域和恒定结构域结构中的任一个结构与另一个结构彼此以非共价缔合，和或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合例如通过二硫键。与全长抗体分子相同，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性例如双特异性的。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合至单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包含本申请所公开的示例性双特异性抗体形式，都可以使用本领域中可用的常规技术调适以用于本发明抗体的抗原结合片段的情形。本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性CDC或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC起作用。“补体依赖性细胞毒性”CDC是指本发明抗体在补体存在下溶解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”ADCC是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体FcR的非特异性细胞毒性细胞例如自然杀伤NK细胞、中性白细胞和巨噬细胞识别靶细胞上结合的抗体并由此引起靶细胞溶解。CDC和ADCC可以使用本领域中众所周知并且可利用的检测来测量。参见例如，美国专利第5,500,362号和第5,821,337号，以及Clynes等人1998《美国国家科学院院刊》美国95:652-656。抗体的恒定区对于抗体固定补体并介导细胞依赖性细胞毒性的能力极为重要。因此，抗体的同型可以基于是否需要抗体来介导细胞毒性进行选择。在本发明的某些实施方式中，本发明的抗GITR抗体是人抗体。如本申请所使用，术语“人抗体”意图包含具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基例如在体外由随机或位点特异性诱变的或在体内由体细胞突变引入的突变，例如在CDR中并且确切地说在CDR3中。然而，如本申请所使用，术语“人抗体”不打算包括这样的抗体：该抗体的CDR序列来源于另一哺乳动物物种如小鼠种系，并被移植至人框架序列上。术语“人抗体”不包含天然存在的分子，所述分子通常未经修饰或未经人为干扰操作地存在于未修饰和天然存在的活生物体中。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是重组人抗体。如本申请所使用，术语“重组人抗体”意图包含通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体在下文进一步描述，如从重组、组合人抗体文库分离的抗体在下文进一步描述，如从人免疫球蛋白基因转基因的动物例如小鼠中分离的抗体参见例如Taylor等人1992，《核酸研究Nucl.AcidsRes.》20:6287-6295，或如通过包含将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中，这类重组人抗体经历体外诱变或当使用关于人Ig序列转基因的动物时，经历体内体细胞诱变，并因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来源于人种系VH和VL序列且与这些序列相关，但可能在体内并非天然存在于人抗体种系谱系内的序列。人抗体可以与铰链异质性有关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不是通过链间二硫键连接并且约75-80kDa的分子是由共价偶合的轻链和重链构成半抗体。这些形式极难分离，即使是在亲和纯化之后也是如此。在各种完整IgG同型中出现所述第二种形式的频率是由但不限于与抗体的铰链区同型有关的结构差异引起。人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代可以使所述第二种形式的出现Angal等人1993《分子免疫学MolecularImmunology》30:105明显减少至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明涵盖了在铰链区、CH2区或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是例如生产中所需要的，以提高所需抗体形式的产率。本发明的抗体可以是分离的抗体。如本申请所使用，“分离的抗体”意思指已被鉴定并从天然环境的至少一种组分中分离和或回收的抗体。例如，出于本发明的目的，从生物体的至少一种组分，或从天然存在或天然产生抗体的组织或细胞分离或取出的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包含在重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和或化学试剂。本申请所公开的抗GITR抗体，相较于得到所述抗体的相应种系序列，可以在重链和轻链可变结构域的框架区和或CDR区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和或缺失。这些突变可以容易地通过比较本申请所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库得到的种系序列来确定。本发明包含来源于本申请所公开的任一个氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成得到所述抗体的种系序列的相应的残基，或另一人种系序列的相应残基，或相应种系残基的保守氨基酸取代此类序列变化在本申请中统称为“种系突变”。本领域的一般技术人员从本申请所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地生产包含一个或多个单种系突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，VH和或VL结构域内的所有框架和或CDR残基回复突变成在得到所述抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施方式中，只有某些残基回复突变成原始种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其它实施方式中，一个或多个框架和或CDR残基突变成不同种系序列即，与最初得到所述抗体的种系序列不同的种系序列中的相应残基。此外，本发明的抗体可以在框架区和或CDR区内含具有两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定种系序列中的相应残基，而不同于原始种系序列的某些其它残基则保持或突变成不同种系序列中的相应残基。在得到含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性视具体情况而定的改善或增强、免疫原性的降低等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。本发明还包括含本申请所公开的任一个HCVR、LCVR和或CDR氨基酸序列的变体的抗GITR抗体，所述变体具有一个或多个保守性取代。例如，本发明包含的抗GITR抗体具有相对于本申请表1中所列的任一个HCVR、LCVR和或CDR氨基酸序列有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和或CDR氨基酸序列。术语“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点称为互补位相互作用的抗原决定簇。单一抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以结合至一个抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物作用。表位可以是构象表位或线性表位。构象表位是通过空间并列的来自线性多肽链不同区段的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况中，表位可以包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。当提到核酸或其片段时，对于术语“实质一致性”或“基本上一致”是指当通过适当核苷酸插入或缺失与另一核酸或其互补链进行最佳地比对时，核苷酸碱基存在至少约95％，并且更优选地，至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸序列一致性，所述一致性可由下文所论述的任何众所周知的序列一致性演算法如FASTA、BLAST或Gap来测量。在某些情况下，与参照核酸分子具有基本一致性的核酸分子可以编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。当应用于多肽时，术语“实质相似性”或“基本上相似”意思指，当两个肽序列进行最佳比对时如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT，具有共有至少95％序列一致性，甚至更优选地，至少98％或99％序列一致性。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被侧链R基团具有类似化学特性例如电荷或疏水性的另一胺基酸残基取代的氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守性取代而彼此不同的情况下，可以上调序列一致性百分比或相似度以校正取代的保守性。用于进行这一调整的手段是本领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson1994《分子生物学方法MethodsMol.Biol.》24:307-331，其以引用的方式并入本申请中。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实施例包括1脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替代是在Gonnet等人1992《科学Science》256:1443-1445以引用的方式并入本申请所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中等保守”替代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。多肽的序列相似性，又称序列一致性，通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用指定到各种取代、缺失和其它修饰包含保守氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有可以使用默认参数的程序如Gap和Bestfit，以测定密切相关的多肽如来自不同生物物种的同源多肽或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列一致性。参见例如6.1版GCG。多肽序列也可以使用FASTA的默认或推荐参数，即第6.1版GCG中的程序进行比较。FASTA例如FASTA2和FASTA3提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比Pearson2000，如前述。当比较本发明序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库时，另一优选的演算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等人1990《分子生物学杂志》215:403-410，和Altschul等人1997《核酸研究NucleicAcidsRes.》25:3389-402，其各自以引用的方式并入本申请中。包括Fc变体的抗GITR抗体根据本发明的某些实施方式，提供了抗GITR抗体，其包括含一个或多个突变的Fc结构域，相较于中性pH，所述突变例如在酸性pH下增进或减少抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域CH2或CH3区中包含突变的抗GITR抗体，其中所述突变在酸性环境例如在pH值在约5.5至约6.0范围内的内体中增加Fc结构域对FcRn的亲和力。在将所述抗体施用给动物时，这些突变可以使所述抗体的血清半衰期增加。此类Fc修饰的非限制性实例包含例如在位置250例如E或Q；250和428例如L或F；252例如LYFW或T、254例如S或T和256例如SRQED或T处的修饰；或在位置428和或433例如HLRSPQ或K和或434例如HF或Y处的修饰；或在位置250和或428处的修饰；或在位置307或308例如308F、V308F和434处的修饰。在一个实施方式中，修饰包括428L例如M428L和434S例如N434S修饰；428L、259I例如V259I和308F例如V308F修饰；433K例如H433K和434例如434Y修饰；252、254和256例如252Y、254T和256E修饰；250Q和428L修饰例如T250Q和M428L；以及307和或308修饰例如308F或308P。例如，本发明包括含Fc结构域的抗GITR抗体，所述Fc结构域包括一对或多对或者一组或多组选自以下组的突变：250Q和248L例如T250Q和M248L；252Y、254T和256E例如M252Y、S254T和T256E；428L和434S例如M428L和N434S；以及433K和434F例如H433K和N434F。前述Fc结构域突变以及在本申请所公开的抗体可变结构域内的其它突变的所有可能组合都涵盖在本发明的范围内。抗GITR抗体的生物特征本发明包含以高亲和力结合单体人GITR的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包含以小于约5.0nM的KD结合单体人GITR例如hGITR.mmh的抗GITR抗体，KD是在37℃下由表面等离子体共振所测量，例如使用如本申请实施例3中所定义的分析形式或基本上类似的分析。在一些实施方式中，提供在37℃下以小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1.50nM的KD结合单体人GITR的抗GITR抗体，KD是由表面等离子体共振所测量，例如使用如本申请实施例3中所定义的分析形式或基本上类似的分析测量。本发明还包含以超过约12分钟的解离半衰期t12结合单体人GITR例如hGITR.mmh的抗体和其抗原结合片段，t12是在37℃下由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。根据某些实施方式，提供了在37℃下以超过约12分钟、超过约13分钟、超过约14分钟、超过约15分钟或更长t12结合单体人GITR的抗GITR抗体，t12是由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。本发明还包含以高亲和力结合二聚体人GITR例如hGITR.mFc的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包含以小于约950pM的KD结合二聚体人GITR的抗GITR抗体，KD是在37℃下由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。根据某些实施方式，提供了在37℃下以小于约900pM、小于约850pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM或小于约100pM的KD结合二聚体人GITR的抗GITR抗体，KD是由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。本发明还包含以超过约7分钟的解离半衰期t12结合二聚体人GITR例如hGITR.mFc的抗体和其抗原结合片段，t12是在37℃下由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。根据某些实施方式，提供了在37℃下以超过约10分钟、超过约20分钟、超过约30分钟、超过约40分钟、超过约50分钟、超过约60分钟、超过约70分钟、超过约80分钟、超过约90分钟、超过约100分钟或更长的t12结合二聚体人GITR的抗GITR抗体，t12是由表面等离子体共振所测量，例如使用本申请实施例3中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。本申请公开还包含结合细胞表面表达的GITR的抗体和其抗原结合片段。例如，本申请提供了以高亲和力结合至人GITR转染的胚肾293HEK-293D9细胞的抗体。例如，本申请公开包含以小于约260pM的EC50结合人GITR转染的胚肾293HEK-293D9细胞的抗GITR抗体，EC50是由电化学发光所测量，例如使用本申请实施例4中所定义的分析形式，或基本上类似的分析测量。在某些实施方式中，提供了以小于约250pM、小于约240pM、小于约230pM或小于约220pM的EC50结合人GITR转染的胚肾293HEK-293D9细胞的抗GITR抗体，EC50是由电化学发光所测量，例如使用本申请实施例4中所定义的分析形式，或大体上类似的分析测量。本发明的抗体可以具有前述生物特征中的一种或多种，或其任何组合。本发明抗体的前述生物特征清单并不详尽。本领域的普通技术人员从包含本申请实施例在内的本申请公开将对本发明抗体的其它生物特征显而易见。依赖于Fc锚定以及不依赖于锚定的GITR活化和GITRL阻断本申请公开包括活化人GITR的抗体和其抗原结合片段，所述活化是例如以本申请实施例5和或实施例6中所描述的分析形式或基本上类似的分析形式所测定。如本申请所使用，“活化人GITR”是指通过与其同源配体——GITR配体GITRL的结合或激动剂抗GITR抗原结合蛋白质与GITR的结合来活化GITR。就通过激动剂抗GITR结合蛋白活化GITR来说，“活化”可以在存在或不存在抗原结合蛋白质锚定至Fcγ受体的情况下实现。人GITR活化是通过遵循某些生物活性体现的，包括但不限于在体外或体内GITR信号传导的诱导或增强、调节性T细胞对效应T细胞活性的抑制作用的降低；在体外或体内循环Treg含量的降低、在体内肿瘤内Tregs的减少、在体外或体内效应T细胞的活化、在体外或体内效应T细胞增殖的诱导或增强，或在体内肿瘤生长的抑制或减慢。在无Fc锚定存在下的GITR活化在一些实施方式中，本申请提供的抗体和其抗原结合片段在无Fc锚定存在下活化人GITR，所述活化是例如以本申请实施例5和或实施例6中所描述的分析形式，或以基本上类似的分析形式所测定。如本申请所使用，“无Fc锚定存在下”是指在无抗GITR抗体群集情况下，不同形式Fcγ受体对GITR和GITR介导的信号传导的活化或GITRL的阻断，并且可以通过例如在体外无细胞表面结合的Fcγ受体存在下共培养的原代T细胞的活化进行测定和定量。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约3nM的EC50以及大于约25％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析，或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约3nM的EC50以及大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约65％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约2nM的EC50以及大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约65％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约1.5nM的EC50以及大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约65％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约1.4nM的EC50以及大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约65％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在无Fc锚定存在下以小于约1.3nM的EC50以及大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约65％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合GITR并在无Fc锚定存在下展现T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合GITR并且在无Fc锚定存在下，以约8nM或更小的EC50展现出T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合GITR并且在无Fc锚定存在下，在约22nM抗体或抗原结合片段浓度下展现出高出背景值至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或至少11倍的T细胞增殖活性，所述活性是由如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。在Fc锚定存在下的GITR活化在一些实施方式中，本申请提供的抗体和其抗原结合片段在Fc锚定存在下活化人GITR，所述活化是例如以本申请实施例5和或实施例6中所描述的分析形式，或以基本上类似的分析形式所测定。如本申请所使用，“在Fc锚定存在下”是指利用抗GITR抗体群集，通过抗体Fc区与不同形式Fcγ受体FcgR，如FcgRI、FcgRIIa或FcgRIIIa的相互作用活化GITR和GITR介导的信号传导或阻断GITRL，并且可以通过例如活化在体外在细胞表面结合的Fcγ受体存在下共培养的T细胞进行测定和定量。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在Fc锚定存在下，在约33nM抗体或抗体结合片段浓度下展现出高出背景值至少约2倍的T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式测定。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段在Fc锚定存在下，在约33nM抗体或抗原结合片段浓度下展现出高出背景值至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍的T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在Fc锚定存在下，以小于约34nM的EC50展现出T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在Fc锚定存在下，以小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM或小于约4nM的EC50展现出T细胞增殖活性，所述活性是由例如实施例6中所描述的初始人CD4+T细胞增殖分析或基本上类似的分析形式所测定。阻断GITR配体介导的受体刺激作用的抗体本申请公开包括阻断人GITR配体hGITRL介导的受体刺激作用的抗体，所述阻断由例如本申请实施例5中所描述的分析形式测定。如本申请所使用，“阻断人GITR配体hGITRL介导的受体刺激作用”是指抗GITR抗原结合蛋白阻断GITR与其同源配位体GITRL的结合的能力。阻断GITR配体可以恢复调节性T细胞对效应T细胞活性的抑制作用。阻断GITR配体可以通过本领域中已知的多种方法进行测定和定量，包括例如减少T细胞增殖或细胞因子分泌，和增加循环调节性T细胞的含量。在一些实施方式中，本申请提供的抗体在无GITR锚定存在下阻断人GITR配体hGITRL介导的受体刺激作用，所述阻断由例如本申请实施例5中所描述的分析形式测定。在一些实施方式中，抗体或其抗体结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约4.0nM的IC50以及大于约55％的阻断百分比阻断人GITR配体介导的受体刺激作用，IC50和阻断百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或其抗体结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约4.0nM、小于约3.0nM、小于约2.0nM、小于约1.0nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM或小于约0.7nM的IC50以及大于约60％、大于约70％、大于约80％或大于约85％的阻断百分比阻断人GITR配体介导的受体刺激作用，IC50和阻断百分比是由例如实施例5中所描述的NFκB报告子分析或基本上类似的分析形式所测定。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下活化人GITR并以小于约25％的阻断百分比阻断人GITR配体介导的受体刺激作用，所述阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定，例如实施例5中所描述的分析或基本上类似的分析。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下活化人GITR并以小于约54％的阻断百分比阻断人GITR配体介导的受体刺激作用，所述阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定，例如实施例5中所描述的分析或基本上类似的分析。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下活化人GITR并以小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约1％的阻断百分比阻断人GITR配体介导的受体刺激作用，所述阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定，例如实施例5中所描述的分析或基本上类似的分析。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以至少约50％的活化百分比活化人GITR并且以大于约50％的阻断百分比不阻断hGITRL介导的受体刺激作用，所述阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定，例如实施例5中所描述的分析或基本上类似的分析。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段活化人GITR并阻断人GITR配体hGITRL介导的受体刺激作用。在一些实施方式中，抗体在无Fc锚定存在下活化人GITR并阻断人GITR配体hGITRL介导的受体刺激作用，这由例如本申请实施例5中所描述的分析形式或基本上类似的分析测定。在一些实施方式中，A抗体或抗原结合片段具有至少一种选自以下组的特性：i.在无Fc锚定存在下，以小于约3nM的EC50以及大于约25％的活化百分比活化人GITR，EC50和活化百分比是由NFκB报告子分析所测定，以及ii.在无Fc锚定存在下，以小于约1.0nM的EC50活化人GITR，EC50是由NFκB报告子分析所测定；并且B抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约4.0nM的IC50以及大于约54％的阻断百分比阻断hGITRL介导的受体刺激作用，IC50和阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定。在一些实施方式中，A抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约1.5nM的EC50以及大于约50％的活化百分比活化人GITR，EC50和活化百分比是由NFκB报告子分析所测定；以及B抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约4.0nM的IC50以及大于约54％的阻断百分比阻断hGITRL介导的受体刺激作用，IC50和阻断百分比是由NFκB报告子分析所测定；以及表位定位和相关技术与本发明抗体所结合的表位可以由GITR蛋白中3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸构成的单一连续序列组成。或者，表位可以由GITR中的多个不连续氨基酸或氨基酸序列组成。在一些实施方式中，表位位于或接近于GITR的GITRL结合结构域。在其它实施方式中，表位位于GITR的GITRL结合结构域的外部，例如在GITR表面上的抗体结合至此类表位时不干扰GITRL与GITR结合的位置。本领域一般技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断分析如《抗体Antibodies》,Harlow和Lane纽约州冷泉港ColdSpringHarb.,NY的ColdSpringHarborPress所描述、丙氨酸扫描突变分析alaninescanningmutationalanalysis、肽印迹分析peptideblotsanalysisReineke,2004,《分子生物学方法MethodsMolBiol》248:443-463和肽裂解分析peptidecleavigeanalysis。此外，可以采用如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰等方法Tomer,2000,《蛋白质科学ProteinScience》9:487-496。可以用于鉴别多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是由质谱法检测的氢氘交换。一般来说，氢氘交换方法包括以氘标记目的蛋白，随后使抗体结合至氘标记的蛋白，接下来，将蛋白抗体复合物转移至水中以使除抗体所保护的残基其保持氘标记外的所有残基发生氢-氘交换，在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此揭露出氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如Ehring1999《分析生物化学AnalyticalBiochemistry》2672:252-259；Engen和Smith2001《分析化学Anal.Chem.》73:256A-265A。本发明还包括与任何本申请所描述的特定的示例性抗体例如包括本申请表1中所列的任一个氨基酸序列的抗体结合至同一表位的抗GITR抗体。同样，本发明还包括与任何本申请所描述的特定的示例性抗体例如包括本申请表1中所列的任一个氨基酸序列的抗体竞争结合GITR的抗GITR抗体。通过使用本领域中已知的和在本申请中举例说明的常规方法可以容易地确定抗体是与参照抗GITR抗体结合至同一表位，或是与参照抗GITR抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗GITR抗体结合至同一表位，使参照抗体结合至GITR蛋白质。接下来，评估测试抗体结合至GITR分子的能力。如果在参照抗GITR抗体饱和结合之后，测试抗体仍能够结合至GITR，则可以得出结论即测试抗体结合至与参照抗GITR抗体不同的表位。另一方面，如果在参照抗GITR抗体饱和结合之后，测试抗体不能够结合至GITR分子，则测试抗体可以结合至与本发明的参照抗GITR抗体所结合的相同的表位。接着可以进行额外常规实验例如肽突变和结合分析以确定所观察到的测试抗体的不结合是否实际上是由与参照抗体结合至同一表位引起，或是空间阻断或另一现象是否引起了所观察到的不结合。此类实验可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可利用的任何其它定量或定性的抗体结合分析来进行。根据本发明的某些实施方式，如果在竞争性结合分析中测量到例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制了另一种抗体的结合至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，则两种抗体结合至同一或重叠表位参见例如Junghans等人，《癌症研究CancerRes.》1990:50:1495-1502。或者，如果抗原中的所有氨基酸突变减少或消除一种抗体的结合，基本上也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合至同一表位。如果仅一小组氨基酸突变减少或消除一种抗体结合也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。为了确定抗体是否与参照抗GITR抗体竞争结合或交叉竞争结合，上述结合方法以两个向进行：在第一种取向中，使参照抗体在饱和条件下结合至GITR蛋白，随后评估测试抗体与GITR分子的结合。在第二种取向中，使测试抗体在饱和条件下结合至GITR分子，随后评估参照抗体与GITR分子的结合。如果在两种取向中，仅第一种饱和抗体能够结合至GITR分子，则可得出结论即测试抗体和参照抗体竞争结合GITR。本领域的一般技术人员应了解，与参照抗体竞争结合的抗体可能未必与参照抗体结合至同一表位，而可以通过结合重叠或相邻表位来空间阻断参照抗体的结合。人抗体的制备本发明的抗GITR抗体可以是完全人抗体。用于产生单克隆抗体包括完全人单克隆抗体的方法是本领域中已知的。任何此类已知方法都可用于本发明中以制备特异性结合至人GITR的人抗体。使用例如VELOCIMMUNETM技术，或用于产生完全人单克隆抗体的任何其它类似的已知方法，最先分离出针对GITR的高亲和力嵌合抗体，其具有人可变区和小鼠恒定区。在以下实验部分中，界定抗体的特征并针对所希望的特征包含亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等进行选择。必要时，小鼠恒定区用所希望的人恒定区例如野生型或修饰过的IgG1或IgG4置换，以产生完全人抗GITR抗体。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变化，但是高亲和力抗原结合和靶特异性特征仍存在于可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性B细胞中分离出完全人抗GITR抗体。生物等效物本发明的抗GITR抗体和抗体片段涵盖了不同于所述抗体所具有的氨基酸序列，但仍能够结合人GITR的蛋白质。这些变体抗体和抗体片段相较于亲本序列包括一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但展现出基本上等效于所述抗体所具有的生物活性。同样，相较于所公开的序列，本发明的编码抗GITR抗体的DNA序列涵盖了包括一个或多个核苷酸添加、缺失或取代的序列，但编码了与本发明的抗GITR抗体或抗体片段基本上生物等效的抗GITR抗体或抗体片段。此类变体氨基酸和DNA序列的实例如上所论述。例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是当在类似实验条件下以单次剂量或多次剂量施用相同摩尔剂量时吸收速率和程度不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则将二者视为生物等效的。如果一些抗体的吸收程度相同但吸收速率不同，则认为这些抗体是等效物或药物替代物，但由于这种吸收速率差异是有意产生的并以标记反映，并非是在例如长期使用中达到有效体内药物浓度所必需的，而且在医学上认为对于所研究的特定药品没有影响，则又可以将这些抗体视为生物等效的。在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白就安全性、纯度和效力在临床上无有意义的差异，则这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。在一个实施方式中，如果患者可以在参照产品与生物产品之间转变一次或多次而不良反应的风险包括临床上显著的免疫原性变化或有效性降低相较于无此类转变的持续疗法无预期增加，则两种抗原结合蛋白质是生物等效的。在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在下都是通过对于一种或多种条件或使用条件的一种或多种共同作用机制起作用，而此类机制是已知的，则这两种抗原结合蛋白是生物等效的。生物等效性可以通过体内和体外方法验证。生物等效性测量包含例如a在人体或其它哺乳动物中进行的体内测试，其中在血液、血浆、血清或其它生物液中随时间测量抗体或其代谢物的浓度；b与人体内生物利用率数据相关并合理地预测这些数据的体外测试；c在人体或其它哺乳动物中进行的体内测试，其中随时间测量抗体或其靶的适当急性药理学作用；以及d确定抗体的安全性、功效或生物利用率或生物等效性的良好控制的临床试验。本发明抗GITR抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种取代，或使生物活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来产生。例如，对于生物活性不重要的半胱氨酸残基可以缺失或用其它氨基酸取代以防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫桥键。在其它情况下，生物等效抗体可以包括含氨基酸变化的抗GITR抗体变体，这些变化改变抗体的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。物种选择性和物种交叉反应性根据某些实施方式，本发明提供了结合至人GITR但不结合至来自其它物种的GITR的抗GITR抗体。本发明还包含结合至人GITR且结合至来自一种或多种非人类物种的GITR的抗GITR抗体。例如，本发明的抗GITR抗体可以结合至人GITR并且视具体情况可以结合或不结合至小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猕猴cynomologous、狨猴、恒河猴或黑猩猩GITR中的一种或多种。根据本发明的某些示例性实施方式，提供了特异性结合人GITR和食蟹猕猴例如食蟹猴MacacafascicularisGITR的抗GITR抗体。本发明的其它抗GIRT抗体结合人GITR，但不结合或仅较弱地结合食蟹猕猴GITR。多特异性抗体本发明的抗体可以是单特异性或多特异性例如双特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或可以含有对超过一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人，1991，《免疫学杂志J.Immunol.》147:60-69；Kufer等人，2004，《生物技术趋势TrendsBiotechnol.》22:238-244。本发明的抗GITR抗体可以连接至另一功能分子例如另一肽或蛋白或与其共表达。例如，抗体或其片段可以功能上连接例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式至一个或多个其它分子实体如另一抗体或抗体片段以产生具有另一结合特异性的双特异性或多特异性抗体。本发明包含双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人GITR，所述免疫球蛋白的另一个臂对另一抗原具有特异性。GITR结合臂可以包括本申请表1中所列的任一个HCVRLCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施方式中，结合GITR的臂结合人GITR并阻断GITRL与GITR的结合。在其它实施方式中，结合GITR的臂结合人GITR，但不阻断GITRL与GITR的结合。在一些实施方式中，结合GITR的臂结合人GITR，并活化GITR信号传导。在其它实施方式中，结合GITR的臂阻断GITRL介导的受体刺激作用。本发明还包含双特异性抗体，其中抗体的一个臂结合人GITR的第一个表位，且所述抗体的另一个臂结合人GITR的第二个不同表位。可以用于本发明中的示例性双特异性抗体形式包括使用第一个免疫球蛋白IgCH3结构域和第二个IgCH3结构域，其中所述第一和第二个IgCH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，并且其中相较于缺乏氨基酸差异的双特异性抗体，该至少一个氨基酸的差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合减少。在一个实施方式中，第一个IgCH3结构域结合蛋白质A而第二个IgCH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰根据IMGT外显子编号；根据EU编号是H435R。第二个CH3还可以包括Y96F修饰根据IMGT；根据EU是Y436F。可在第二个CH3内发现的其它修饰包含：在IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I根据IMGT；根据EU是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I；在IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82IIMGT；根据EU是N384S、K392N和V422I；以及在IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I根据IMGT；根据EU是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I。以上描述的双特异性抗体形式的变异涵盖在本发明的范围内。可以用于本发明的其它示例性双特异性形式包括但不限于例如基于ScFv的或双功能抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域DVD-Ig、四源杂交瘤、纽扣结构knobs-into-holes、共用轻链例如具有纽扣结构的共用轻链等、交叉单克隆抗体CrossMab、交叉抗原结合片段CrossFab、SEED体SEEDbody、亮氨酸拉链、双特异性抗体Duobody、IgG1IgG2、双重作用FabDAF-IgG及Mab2双特异性形式关于前述形式的评述，参见例如Klein等人，2012,mAbs4:6,1-11，及其中引用的参考文献。双特异性抗体还可使用肽核酸偶联构建，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸产生位点特异性抗体-寡核苷酸偶联物，这些偶联物随后自组装成具有确定组成、价态和几何形状的多聚复合物。参见例如Kazane等人，《美国化学学会杂志J.Am.Chem.Soc.》[电子版：2012年12月4日]。治疗性配制物和施用本发明提供了包括本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物用适合的载剂、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等的其它试剂一起配制。众多的适当配制物可见于所有医药化学家已知的处方集中：《雷氏药学大全Remington'sPharmaceuticalSciences》，宾夕法尼亚州伊斯顿Easton,PA的MackPublishingCompany。这些配制物包含例如散剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质阳离子或阴离子脂质的囊泡如LIPOFECTINTM，加利福尼亚州卡尔斯巴德Carlsbad,CA的LifeTechnologies、DNA偶联物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液卡波蜡carbowax具有多种分子量的聚乙二醇、半固体凝胶及含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，Compendiumofexcipientsforparenteralformulations,PDA1998，《药物科学与技术杂志》52:238-311。施用给患者的抗体的剂量可以取决于患者的年龄和体格、目标疾病、病症、施用途径等而变化。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。对于成年患者，通常以每公斤体重约0.01至约20mg，更优选地每公斤体重约0.02至约7mg、约0.03至约5mg或约0.05至约3mg的单次剂量静脉内施用本发明的抗体可能是有利的。取决于病况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。施用抗GITR抗体的有效剂量和时程可以凭经验确定；例如，可通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，还可以使用本领域中众所周知的方法按比例调整物种间剂量标度例如Mordenti等人，1991，《药学研究Pharmaceut.Res.》8:1351。各种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，所述药物组合物例如以脂质体、微米粒子、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用包封参见例如Wu等人,1987,《生物化学杂志J.Biol.Chem.》262:4429-4432。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或快速注射、通过上皮或粘膜皮肤内层例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等吸收施用，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。本发明的药物组合物可用标准注射针和注射器皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易于用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般使用含有药物组合物的可更换筒。一旦筒内的所有药物组合物都已被施用并且筒变空时，可以容易地丢弃空筒并更换为含药物组合物的新筒。所述笔式递送装置随后可再使用。在一次性笔式传递装置中，没有可更换的筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦排空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。多种可重复使用的笔式和自动注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM英国伍德斯托克Woodstock,UK的OwenMumford,Inc.、DISETRONICTM笔瑞士布格多夫Bergdorf,Switzerland的DisetronicMedicalSystems、HUMALOGMIX7525TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN7030TM笔印第安纳州印第安纳波利斯Indianapolis,IN的EliLillyandCo.、NOVOPENTMI、II和III丹麦哥本哈根Copenhagen,Denmark的NovoNordisk、NOVOPENJUNIORTM丹麦哥本哈根的NovoNordisk、BDTM笔新泽西州富兰克林湖FranklinLakes,NJ的BectonDickinson、OPTIPENTM、OPTIPENPROTM、OPTIPENSTARLETTM及OPTICLIKTM德国法兰克福Frankfurt,Germany的sanofi-aventis等。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔sanofi-aventis、FLEXPENTMNovoNordisk和KWIKPENTMEliLilly、SURECLICKTM自动注射器加利福尼亚州千橡树市ThousandOaks,CA的安进、PENLETTM德国斯图加特Stuttgart,Germany的Haselmeier、EPIPENDey,L.P.以及HUMIRATM笔伊利诺伊州阿博特帕克AbbottParkIL的AbbottLabs等。在某些情形下，药物组合物可以通过控制释放系统递送。在一个实施方式中，可以使用泵参见Langer，如前述；Sefton,1987,《CRC生物医学工程评论综述CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.》14:201。在另一个实施方式中，可使用聚合材料；参见《控制释放的医学应用MedicalApplicationsofControlledRelease》，Langer和Wise编,1974,CRCPres.,佛罗里达州波卡拉顿BocaRaton,Florida。在又另一实施方式中，控制释放系统可以放在组合物的靶附近，由此只需要全身剂量的一部分参见例如Goodson,1984，《控制释放的医学应用》，如前述，第2卷，第115-138页。其它控制释放系统论述于Langer,1990,《科学》,249:1527-1533的评述中。可注射制剂可以包含供静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输注等用的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。例如，可注射制剂可例如通过在常用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐来制备。作为注射用水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，这些可以与合适的增溶剂如醇例如乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50聚氧化乙烯50mol与氢化蓖麻油的加合物]等组合使用。作为油性介质，采用了例如芝麻油、大豆油等，这些可以与增溶剂如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当的安瓿中。有利地，将上述供口服或肠胃外使用的药物组合物制备成呈适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊、注射液安瓿、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般是呈每种剂型约5至约500mg的单位剂量；尤其是对于注射液形式，优选地，所包含的前述抗体是约5至约100mg，对于其它剂型，优选地是约10至约250mg。抗体的治疗用途本发明包含的方法包括向有需要的受试者施用治疗性组合物，所述治疗性组合物包括抗GITR抗体例如含本申请表1中所列的任一个HCVRLCVR或CDR序列的抗GITR抗体。治疗性组合物可以包括本申请所公开的抗GITR抗体、其抗原结合片段或ADC中的任一种，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。本发明的抗体特别适用于治疗、预防和或改善与GITR表达或活性有关或由GITR表达或活性介导，或可通过阻断GITR与GITRL之间的相互作用、和或抑制或刺激GITR活性和或信号传导治疗的任何疾病或病症。例如，可以使用本申请公开的抗体和抗原结合片段，通过例如GITR活化调节免疫反应来治疗免疫和增生性疾病或病症，例如癌症。可以使用本申请公开的抗体和抗原结合片段增强免疫反应来治疗疾病或病症。本申请公开包含调节受试者的抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本申请所描述的抗GITR抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段降低调节性T细胞对效应T细胞的抑制活性。在一些实施方式中，本申请公开的抗体或抗原结合片段增大有助于治疗的肿瘤内T效应子调节性T细胞的比率。在一些实施方式中，本申请公开的抗体或抗原结合片段促进T细胞存活。可以用抗体和抗原结合片段治疗的示例性疾病或病症包括免疫和增生性疾病或病症，例如癌症。本发明的抗体和抗原结合片段可以用于治疗脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨、皮肤和附件、结缔组织、脾、免疫系统、血液形成细胞和骨髓、肝和泌尿道，以及特定感觉器官如眼睛中产生的原发性和或转移性肿瘤。在一些实施方式中，使用了本申请公开的抗体和抗原结合片段治疗实体肿瘤或血源性肿瘤。在某些实施方式中，使用了本申请公开的抗体治疗以下癌症中的一种或多种：肾细胞癌、胰腺癌瘤、头颈癌、前列腺癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌例如出现MET扩增的胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌、黑素瘤、睾丸癌、肾癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌或肝癌。在某些实施方式中，本发明的抗体可用于治疗自体免疫疾病，包括但不限于斑秃、自体免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病Graves'disease、吉兰-巴雷综合征Guillain-Barresyndrome、桥本氏病Hashimoto'sdisease、溶血性贫血、炎症性肠病、炎症性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病、休格连氏综合征syndrome、全身性红斑狼疮、白斑病、自体免疫性胰腺炎、自体免疫性荨麻疹、自体免疫性血小板减少性紫癜、克罗恩氏病Crohn'sdisease、I型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、古德帕斯彻综合征Goodpasture'ssyndrome、重症肌无力、牛皮癣性关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病Wegener'sgranulomatosis。在本申请所描述的治疗方法情况下，可以施用抗GITR抗体作为单药疗法即，作为唯一治疗剂或抗GITR抗体与一种或多种另外的治疗剂其实例描述于本申请的别处的组合。组合疗法和配制物本申请还提供了利用本申请公开的抗GITR抗体和任何另外的治疗剂的组合疗法，所述另外的治疗剂可以有利地与本申请公开的抗体或其抗原结合片段组合。本发明包括含有任何本申请所描述的抗GITR抗体结合一种或多种另外的治疗活性组分的组合物和治疗性配制物，以及治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用此类组合。本发明的抗体可以与一种或多种用于治疗癌症的抗癌药物或疗法协同组合，所述癌症包括例如肾细胞癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤和黑素瘤。本申请中涵盖使用本发明的抗GITR抗体与免疫刺激和或免疫抑制疗法的组合来抑制肿瘤生长，和或增进癌症患者的存活。免疫刺激疗法包含直接免疫刺激疗法，所述疗法通过对受抑制的免疫细胞“释放刹车分子”releasingthebrake或“加油”steppingonthegas以活化免疫反应来加强免疫细胞活性。实例包含靶向其它检查点受体、疫苗接种和佐剂。免疫支持模式可以通过促进免疫原性细胞死亡、炎症来增加肿瘤的抗原性，或具有促进抗肿瘤免疫反应的其它间接作用。实例包含放射、化学疗法、抗血管生成剂和手术。本申请公开包含调节受试者的抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用抗GITR抗体与一种或多种针对活化受体的激动抗体和一种或多种针对抑制性受体的阻断抗体的组合，由此增强T细胞刺激作用以促进肿瘤破坏。本申请公开包含调节受试者的抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本申请所描述的抗GITR抗体或抗原结合片段与一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段的组合，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合至另一种T细胞活化受体即，不是GITR。在一些实施方式中，所述另一种T细胞活化受体是CD28、OX40、CD137、CD27或VEM。本申请公开还包含配制物，所述配制物包括本申请提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段和结合所述另一种T细胞活化受体的抗体或抗原结合片段。在各种实施方式中，本发明的一种或多种抗体可以与以下各物组合使用：针对PD-L1的抗体、针对PD-1的抗体例如纳武单抗nivolumab、LAG-3抑制剂、CTLA-4抑制剂例如伊派利单抗ipilimumab、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、另一T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂例如针对CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗体、吲哚胺-2,3-双加氧酶IDO抑制剂、血管内皮生长因子VEGF拮抗剂[例如“VEGF-Trap”，如阿柏西普aflibercept或US7,087,411中所述的其它VEGF抑制性融合蛋白，或抗VEGF抗体或其抗原结合片段例如贝伐单抗bevacizumab或兰尼单抗ranibizumab或VEGF受体的小分子激酶抑制剂例如舒尼替尼sunitinib、索拉非尼sorafenib或帕唑帕尼pazopanib]、Ang2抑制剂例如耐西维单抗nesvacumab、转化生长因子βTGFβ抑制剂、表皮生长因子受体EGFR抑制剂例如埃罗替尼erlotinib、西妥昔单抗cetuximab、针对共刺激受体的激动剂例如针对糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质的激动剂、针对肿瘤特异性抗原例如CA9、CA125、黑素瘤相关抗原3MAGE3、癌胚抗原CEA、波形蛋白、肿瘤-M2-PK、前列腺特异性抗原PSA、粘蛋白-1、MART-1和CA19-9的抗体、疫苗例如卡介苗BacillusCalmette-Guerin，一种癌症疫苗、用于增加抗原呈递的佐剂例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、双特异性抗体例如CD3×CD20双特异性抗体、PSMA×CD3双特异性抗体、细胞毒素、化学治疗剂例如达卡巴嗪dacarbazine、替莫唑胺temozolomide、环磷酰胺cyclophosphamide、多西他赛docetaxel、多柔比星doxorubicin、道诺霉素daunorubicin、顺铂cisplatin、卡铂carboplatin、吉西他滨gemcitabine、甲氨蝶呤methotrexate、米托蒽醌mitoxantrone、奥沙利铂oxaliplatin、太平洋紫杉醇paclitaxel和长春新碱vincristine、环磷酰胺、放射疗法、IL-6R抑制剂例如沙瑞卢单抗sarilumab、IL-4R抑制剂例如杜匹鲁单抗dupilumab、IL-10抑制剂、细胞因子如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15、抗体-药物偶联物ADC例如抗CD19-DM4ADC和抗DS6-DM4ADC、消炎药例如皮质类固醇和非类固醇消炎药、膳食补充剂如抗氧化剂或用于治疗癌症的任何姑息性护理。在某些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可以与包括树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等癌症疫苗组合使用以加强抗肿瘤反应。可与本发明的抗GITR抗体组合使用的癌症疫苗的实例包括针对黑素瘤和膀胱癌的MAGE3疫苗、针对乳癌的MUC1疫苗、针对脑癌包括多形性胶质母细胞瘤的EGFRv3例如林多匹特Rindopepimut或ALVAC-CEA针对CEA+癌症。在一些实施方式中，将一种或多种本申请所描述的抗GITR抗体与一种或多种抗PD1抗体组合施用，所述抗PD1抗体包括但不限于以全文引用的方式并入本文中的美国专利公开第20150203579号中所描述的抗体。在一些实施方式中，抗GITR抗体是H1H14536P2或H2aM14536P2。在一些实施方式中，抗PD1抗体是REGN2810又称为H4H7798N，如美国专利公开第20150203579号中所公开、帕博利珠单抗pembrolizumab或纳武单抗。在某些实施方式中，在用于产生长期持续抗肿瘤反应和或促进癌症患者存活的方法中，本发明的抗GITR抗体可以与放射疗法组合施用。在一些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可以在施用放射疗法之前、同时或之后施用给癌症患者。例如，放射疗法可以分一次或多次剂量施用至肿瘤病变，随后施用一次或多次剂量的本发明的抗GITR抗体。在一些实施方式中，放射疗法可以局部施用至肿瘤病变以增强患者肿瘤的局部免疫原性辅助性adjuvinating放射和或杀灭肿瘤细胞消融性放射，随后全身施用本发明的抗GITR抗体。例如，向患有脑癌例如多形性胶质母细胞瘤的患者施用颅内放射可以与全身施用本发明的抗GITR抗体组合。在某些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可与放射疗法和化学治疗剂例如替莫唑胺或环磷酰胺或VEGF拮抗剂例如阿柏西普组合施用。在某些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可以与一种或多种抗病毒药物组合施用以治疗由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV引起的慢性病毒感染。抗病毒药物的实例包括但不限于齐多夫定zidovudine、拉米夫定lamivudine、阿巴卡韦abacavir、利巴韦林ribavirin、洛匹那韦lopinavir、依法韦仑efavirenz、考比斯他cobicistat、替诺福韦tenofovir、利匹韦林rilpivirine和皮质类固醇。在一些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可以与LAG3抑制剂、CTLA-4抑制剂或另一T细胞共抑制剂的任一拮抗剂组合施用以治疗慢性病毒感染。在某些实施方式中，本发明的抗GITR抗体可以与针对免疫细胞上的Fc受体的抗体组合以治疗自体免疫疾病。在一个实施方式中，将本发明的抗体或其片段与靶向自体免疫组织特异性抗原的抗体或抗原结合蛋白组合施用。在某些实施方式中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与靶向T细胞受体或B细胞受体包括但不限于Fcα例如CD89、Fcγ例如CD64、CD32、CD16a和CD16b、CD19等的抗体或抗原结合蛋白质组合施用。本发明的抗体或其片段可与本领域中已知的任何药物或疗法例如皮质类固醇和其它免疫抑制剂组合使用以治疗自体免疫疾病或病症，包括但不限于斑秃、自体免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏病、溶血性贫血、炎症性肠病、炎症性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病、休格连氏综合征、全身性红斑狼疮、白斑病、自体免疫性胰腺炎、自体免疫性荨麻疹、自体免疫性血小板减少性紫癜、克罗恩氏病、I型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、古德帕斯彻综合征、重症肌无力、牛皮癣性关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。本申请公开还包含调节受试者的抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本申请所描述的抗GITR抗体或抗原结合片段与一种或多种结合至T细胞抑制性受体的分离的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施方式中，T细胞抑制性受体是CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3。本申请公开还包含配制物，所述配制物包括本申请提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段和结合所述T细胞抑制性受体的抗体或抗原结合片段。本申请公开还包含通过向受试者施用本申请所描述的抗体或其抗原结合片段或配制物，以及放射或化学疗法来治疗癌症的方法。在一些实施方式中，将本发明的抗GITR抗体与一种或多种另外的治疗活性组分共配制和或组合施用，所述一种或多种另外的治疗活性组分选自以下组：EGFR拮抗剂例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗cetuximab或帕尼单抗panitumumab]或EGFR的小分子抑制剂[例如吉非替尼gefitinib或埃罗替尼erlotinib]、另一个EGFR家族成员如Her2ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂例如抗ErbB2[例如曲妥珠单抗trastuzumab或T-DM1]、抗ErbB3或抗ErbB4抗体，或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂、EGFRvIII的拮抗剂例如特异性结合EGFRvIII的抗体、cMET拮抗剂例如抗cMET抗体、IGF1R拮抗剂例如抗IGF1R抗体、B-raf抑制剂例如维罗非尼vemurafenib、索拉非尼sorafenib、GDC-0879、PLX-4720、PDGFR-α抑制剂例如抗PDGFR-α抗体、PDGFR-β抑制剂例如抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂如甲磺酸伊马替尼imatinibmesylate或苹果酸舒尼替尼sunitinibmalate、PDGF配体抑制剂例如抗PDGF-A、抗PDGF-B、抗PDGF-C或抗PDGF-D抗体、适体、siRNA等、VEGF拮抗剂例如VEGF-Trap，如阿柏西普aflibercept，参见例如US7,087,411在本申请中又称为“VEGF抑制性融合蛋白”、抗VEGF抗体例如贝伐单抗bevacizumab、VEGF受体的小分子激酶抑制剂例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼、DLL4拮抗剂例如US20090142354中所公开的抗DLL4抗体，如REGN421、Ang2拮抗剂例如US20110027286中所公开的抗Ang2抗体，如H1H685P、FOLH1拮抗剂例如抗FOLH1抗体、STEAP1或STEAP2拮抗剂例如抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体、TMPRSS2拮抗剂例如抗TMPRSS2抗体、MSLN拮抗剂例如抗MSLN抗体、CA9拮抗剂例如抗CA9抗体、尿溶蛋白拮抗剂例如抗尿溶蛋白[例如抗UPK3A]抗体、MUC16拮抗剂例如抗MUC16抗体、Tn抗原拮抗剂例如抗Tn抗体、CLEC12A拮抗剂例如抗CLEC12A抗体、TNFRSF17拮抗剂例如抗TNFRSF17抗体、LGR5拮抗剂例如抗LGR5抗体、单价CD20拮抗剂例如单价抗CD20抗体，如利妥昔单抗rituximab等。可以有利地与本发明的抗体组合施用的其它药剂包括例如他莫昔芬tamoxifen、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合至细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其相应受体的抗体。本发明包括含任何本申请所描述的抗GITR抗体与一种或多种化疗剂的组合的组合物和治疗性配制物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派thiotepa和环磷酰胺CytoxanTM；烷基磺酸盐，如白消安busulfan、英丙舒凡improsulfan和哌泊舒凡piposulfan；氮丙啶aziridine，如苯唑多巴benzodopa、卡波醌carboquone、米特多巴meturedopa和尤利多巴uredopa；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺altretamine、曲他胺triethylenemelamine、三亚乙基磷酰胺trietylenephosphoramide、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥nitrogenmustards，如苯丁酸氮芥chlorambucil、萘氮芥chlornaphazine、胆磷酰胺cholophosphamide、雌莫司汀estramustine、异环磷酰胺ifosfamide、甲氮芥mechlorethamine、甲氮芥氧化物盐酸盐、美法仑melphalan、新氮芥novembichin、苯芥胆甾醇phenesterine、泼尼氮芥prednimustine、曲磷胺trofosfamide、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀carmustine、氯脲菌素chlorozotocin、福莫司汀fotemustine、洛莫司汀lomustine、尼莫司汀nimustine、雷莫司汀ranimustine；抗生素，如阿克拉霉素aclacinomysins、放射菌素actinomycin、氨茴霉素authramycin、氮杂丝氨酸azaserine、博来霉素bleomycins、放线菌素Ccactinomycin、卡奇霉素calicheamicin、卡柔比星carabicin、洋红霉素carminomycin、嗜癌霉素carzinophilin、色霉素chromomycins、放线菌素Ddactinomycin、道诺霉素daunorubicin、地托比星detorubicin、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星doxorubicin、表柔比星epirubicin、依索比星esorubicin、伊达比星idarubicin、麻西罗霉素marcellomycin、丝裂霉素mitomycins、霉酚酸mycophenolicacid、诺拉霉素nogalamycin、橄榄霉素olivomycins、培洛霉素peplomycin、甲基丝裂霉素potfiromycin、嘌呤霉素puromycin、奎那霉素quelamycin、罗多比星rodorubicin、链黑霉素streptonigrin、链脲霉素streptozocin、杀结核菌素tubercidin、乌苯美司ubenimex、净司他丁zinostatin、左柔比星zorubicin；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶5-FU；叶酸类似物，如二甲叶酸denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤pteropterin、三甲曲沙trimetrexate；嘌呤类似物，如氟达拉宾fludarabine、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤thiamiprine、硫鸟嘌呤thioguanine；嘧啶类似物，如安西他滨ancitabine、阿扎胞苷azacitidine、6-氮尿苷、卡莫氟carmofur、阿糖胞苷cytarabine、双去氧尿苷dideoxyuridine、去氧氟尿苷doxifluridine、依诺他滨enocitabine、氟尿苷floxuridine；雄激素，如二甲睾酮calusterone、丙酸甲雄烷醇酮dromostanolonepropionate、环硫雄醇epitiostanol、美雄烷mepitiostane、睾内酯testolactone；抗肾上腺，如氨鲁米特aminoglutethimide、米托坦mitotane、曲洛司坦trilostane；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯aceglatone；醛磷酰胺糖苷aldophosphamideglycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶amsacrine；阿莫司汀bestrabucil；比生群bisantrene；依达曲沙edatraxate；地磷酰胺defofamine；秋水仙碱demecolcine；地吖醌diaziquone；依氟鸟氨酸elfornithine；乙酸依利铵elliptiniumacetate；依托格鲁etoglucid；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖lentinan；氯尼达明lonidamine；丙脒腙mitoguazone；米托蒽醌mitoxantrone；莫哌达醇mopidamol；硝氨吖啶nitracrine；喷司他汀pentostatin；凡那明phenamet；吡柔比星pirarubicin；鬼臼酸podophyllinicacid；2-乙酰肼；丙卡巴肼procarbazine；PSKTM；雷佐生razoxane；西佐糖sizofiran；锗螺胺spirogermanium；细交链孢菌酮酸tenuazonicacid；三亚胺醌triaziquone；2,2',2”-三氯三乙基胺；乌拉坦urethan；长春地辛vindesine；达卡巴嗪dacarbazine；甘露氮芥mannomustine；二溴甘露醇mitobronitol；二溴卫矛醇mitolactol；哌泊溴烷pipobroman；甲托辛gacytosine；阿拉伯糖苷“Ara-C”；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇TaxolTM，新泽西州普林斯顿Princeton,N.J.的Bristol-MyersSquibbOncology和多西他赛TaxotereTM；法国的AventisAntony；苯丁酸氮芥；吉西他滨gemcitabine；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱vinblastine；铂；依托泊苷etoposideVP-16；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱vincristine；长春瑞宾vinorelbine；诺维本navelbine；诺凡特龙novantrone；替尼泊苷teniposide；道诺霉素daunomycin；氨基蝶呤aminopterin；希罗达xeloda；伊班膦酸盐ibandronate；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟胺酸DMFO；视黄酸；埃斯波霉素esperamicins；卡培他滨capecitabine；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包含用以调控或抑制针对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包含例如他莫昔芬、雷诺昔芬raloxifene、芳香酶抑制45-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬trioxifene、盐酸雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮onapristone和托瑞米芬toremifeneFareston；和抗雄激素，如氟他胺flutamide、尼鲁米特nilutamide、比卡鲁胺bicalutamide、亮丙立德leuprolide和戈舍瑞林goserelin；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。本发明的抗GITR抗体还可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、COX抑制剂、保心药、金属螯合剂、IFN-γ和或NSAID组合施用和或共配制。所述另外的治疗活性组分，例如上文所列药剂中的任一种或其衍生物，可以在即将施用本发明的抗GITR抗体之前、在施用本发明的抗GITR抗体同时或在施用本发明的抗GITR抗体之后不久施用；出于本申请公开的目的，这种施用方案被视为抗GITR抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用。本发明包含将本发明的抗GITR抗体与一种或多种如本申请别处所描述的另外的治疗活性组分共配制的药物组合物。所述另外的治疗活性组分可以在施用本发明的抗GITR抗体之前施用给受试者。例如，如果第一种组分是在施用第二种组分之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟或不到1分钟施用，则可以认为第一种组分是在第二种组分“之前”施用。在其它实施方式中，所述另外的治疗活性组分可以在施用本发明的抗GITR抗体之后施用给受试者。例如，如果第一种组分是在施用第二种组分之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，则可以认为第一种组分是在第二种组分“之后”施用。在又一些其它实施方式中，所述另外的治疗活性组分可以在施用本发明的抗GITR抗体的同时施用给受试者。出于本发明的目的，“同时”施用包括例如以单一剂型例如共配制将抗GITR抗体和另外的治疗活性组分施用给受试者，或将抗GITR抗体和另外的治疗活性组分以独立剂型彼此间隔约30分钟或更短时间施用给受试者。如果以独立剂型施用的，则各剂型可以通过相同途径施用例如抗GITR抗体和所述另外的治疗活性组分可以以静脉内、皮下等施用；或者，各剂型可以通过不同途径施用例如抗GITR抗体可以静脉内施用，并且所述另外的治疗活性组分可以皮下施用。在任何情况下，出于本申请的目的，以单一剂型、通过相同途径以独立剂型、或通过不同途径以独立剂型施用所述组分都被认为是“同时施用”。出于本申请公开的目的，在施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”这些术语如上文所定义施用抗GITR抗体被视为施用抗GITR抗体与另外的治疗活性组分的“组合”。本发明包含使用多种剂量组合将本发明的抗GITR抗体与如本申请别处所描述的一种或多种另外的治疗活性组分共配制的药物组合物。在示例性的实施方式中，本发明的抗GITR抗体与VEGF拮抗剂例如VEGFtrap，如阿柏西普组合施用，包括施用含抗GITR抗体和VEGF拮抗剂的共配制物，个别组分可以使用多种剂量组合施用给受试者和或共配制。例如，施用给受试者和或包含在共配制物中的抗GITR抗体的量可以选自以下组：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg以及10.0mg；并且施用给受试者和或包含在共配制物中的VEGF拮抗剂例如VEGFtrap，如阿柏西普的量可以选自以下组：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg以及3.0mg。所述组合共配制物可以根据本申请别处所公开的施用方案中的任一种施用给受试者，包括例如一周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。施用方案根据本发明的某些实施方式，可以在确定的时程内向受试者施用多剂量的抗GITR抗体或包括抗GITR抗体与本申请中提到的任何另外的治疗活性剂的组合的药物组合物。根据本发明这一方面，施用方法包括向受试者依序施用多剂量的本发明的抗GITR抗体。如本申请所使用，“依序施用”意思指在不同时间点，例如在隔开预定间隔例如数小时、数天、数周或数月的不同日子向受试者施用各剂量的抗GITR抗体。本发明包含的方法包括向患者依序施用单一初始剂量的抗GITR抗体，随后施用一剂或多剂第二剂量的抗GITR抗体，且任选地随后施用一次或多次第三剂量的抗GITR抗体。术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用本发明的抗GITR抗体的时间序列。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量又称“基线剂量”；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”"是在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的抗GITR抗体，但施用频率一般可能彼此不同。然而，在某些实施方式中，初始、第二和或第三剂量中所含抗GITR抗体的量在治疗过程期间彼此不同例如适当上调或下调。在某些实施方式中，两次或更多次例如2、3、4或5次剂量在治疗方案开始时是以“负荷剂量”施用，随后以较小频率施用后续剂量例如“维持剂量”。在本发明的某些示例性实施方式中，每次第二和或第三剂量是紧接前次剂量之后1至26例如1、112、2、212、3、312、4、412、5、512、6、612、7、712、8、812、9、912、10、1012、11、1112、12、1212、13、1312、14、1412、15、1512、16、1612、17、1712、18、1812、19、1912、20、2012、21、2112、22、2212、23、2312、24、2412、25、2512、26、2612或更多周施用。如本申请所使用，短语“紧接前次剂量”意思指在一系列多次施用中，在所述系列中紧接着的下次剂量之前施用给患者的抗GITR抗体的剂量，且其中无干预剂量。根据本发明这一方面的方法可以包括向患者施用任何数量的第二和或第三剂量的抗GITR抗体。例如，在某些实施方式中，仅向患者施用单次的第二剂量。在其它实施方式中，向患者施用两次或更多次的例如2、3、4、5、6、7、8或更多次第二剂量。同样，在某些实施方式中，仅向患者施用单次的第三剂量。在其它实施方式中，向患者施用两次或更多次的例如2、3、4、5、6、7、8或更多次第三剂量。施用方案可以在特定受试者的一生中无限地进行，或直至此类治疗在治疗上不再被需要或不再有利。在涉及多次第二剂量的实施方式中，每次第二剂量可以按与其它第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以在紧接前次剂量之后1至2周或1至2个月施用给患者。类似地，在涉及多次第三剂量的实施方式中，每次第三剂量可以按与其它第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量在紧接前次剂量之后的2至12周施用给患者。在本发明的某些实施方式中，向患者施用第二和或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程内变化。医生在临床检查后，可以在治疗过程期间根据个别患者的需要来调整施用频率。本发明包含以下施用方案，在这些施用方案中，以第一频率例如一周一次、每两周一次、每三周一次、一个月一次、每两个月一次等向患者施用2次至6次负荷剂量，随后以较低频率向患者施用两次或更多次维持剂量。例如，根据本发明这一方面，如果负荷剂量是以一个月一次的频率施用，则可以每六周一次、每两个月一次、每三个月一次等向患者施用维持剂量。抗体的诊断用途本发明的抗GITR抗体还可用于检测和或测量样品中的GITR或GITR表达细胞，例如用于诊断目的。例如，抗GITR抗体或其片段可用于诊断以GITR表达异常例如过度表达、表达不足、不表达等为特征的病况或疾病。针对GITR的示例性诊断分析可以包括例如使从患者处获得的样品与本发明的抗GITR抗体接触，其中抗GITR抗体标记有可检测标记或报告分子。或者，未标记的抗GITR抗体可以与本身具有可检测标记的另一抗体组合以用于诊断应用中。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；可以是荧光或化学发光部分，如荧光素或罗丹明rhodamine；或可以是酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的GITR的具体示例性分析包含酶联结免疫吸附分析法ELISA、放射免疫分析RIA、免疫PET例如89Zr、64Cu等和荧光活化细胞分选FACS。可以用于根据本发明的GITR诊断分析中的样品包含在正常或病理条件下能从患者处获得的含有可检测量的GITR蛋白质或其片段的任何组织或流体样品。一般来说，将测量从健康患者例如未罹患与异常GITR含量或活性有关的疾病或病况的患者处获得的特定样品中GITR的含量以最初地建立为GITR的基线或标准含量。接着，可以将这一基线GITR含量与从疑似患有GITR相关疾病或病况的个体处获得的样品所测得的GITR的含量相比较。实施例阐述以下实施例以便向本领域一般技术人员提供有关如何制备并使用本发明方法和组合物的完整公开内容和描述，并且这些实施例不打算限制本发明人视为其发明的内容的范围。已经努力确保所用数字例如数量、温度等的准确度，但应该考虑到仍存在一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度为单位并且压力是大气压或接近大气压。实施例1.抗GITR抗体的产生通过用包括可溶性二聚人GITR胞外结构域的免疫原对小鼠即，包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的工程改造过的小鼠进行免疫接种，获得抗GITR抗体。利用GITR特异性免疫分析监测抗体免疫反应。如US20070280945A1中所描述，直接从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞分离出若干完全人抗GITR抗体。根据本实施例的方法产生的示例性抗GITR抗体的某些生物特性详细地描述于以下阐述的实施例中。实施例2.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列表1阐述了选自本发明的抗GITR抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。表2中阐述了相应的核酸序列标识符。表1：氨基酸序列标识符表2：核酸序列标识符如表1和2中所示，抗体在本申请中通常根据以下命名法提及：Fc前缀例如“H1H”、“H4H”等，之后是数字标识符例如“14493”、“14495”等，之后是“P”或“P2”后缀。因此，根据此命名法，抗体在本申请中可以被称为例如“H1H14486P”、“H4H14531P2”等。本申请所使用的抗体名称中的H1H和H4H前缀指示抗体的特定Fc区同型。例如，“H1H”抗体具有人IgG1Fc，“H4H”抗体具有人IgG4Fc，并且H2M具有小鼠IgG2Fc如抗体名称中的第一个‘H’所指示，所有可变区都是完全人类的。本领域的一般技术人员应了解，具有特定Fc同型的抗体可以转化成具有不同Fc同型的抗体，但在任何情况下，以表1和2中所显示的数字标识符指示的可变结构域包含CDR仍是相同的，并且不管Fc结构域的性质如何，预其期结合特性是一致或基本上类似的。以下实施例中使用的对照构建体在以下实验中包含对照构建体以用于比较目的：抗GITR对照AbI：可变重链和轻链结构域具有如WO2006105021A2中所述“克隆6C8”的相应结构域的氨基酸序列的小鼠抗人GITR杂交瘤；在以下实施例中用mIgG1和mIgG2a恒定区制造；和抗GITR对照AbII：可变重链和轻链结构域具有如US8709424B2中所述“36E5”的相应结构域的氨基酸序列的人抗GITR抗体。实施例3.由表面等离子体共振得到的人单克隆抗TNFRSF18GITR抗体的结合亲和力和动力学常数在37℃下，利用表面等离子体共振Biacore4000或T-200测定人抗GITR抗体的结合亲和力和动力学常数表3。将表示为人IgG1或IgG4即，“H1H”或“H4H”名称的抗体捕捉至小鼠抗人FcCM5Biacore传感器表面mAb捕捉形式和可溶性单体人hGITR.mmh；SEQIDNO:409和食蟹猴mfGITR.mmh；SEQIDNO:412或二聚体hGITR.hFc；SEQIDNO:411和hGITRmFc；SEQIDNO:410上。GITR蛋白以30μLmin的流动速率注射至传感器表面上。所有Biacore结合研究都是在由0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05％vv表面活性剂P20构成的缓冲液HBS-ET操作缓冲液中进行。监测抗体-试剂缔合4分钟，同时监测在HBS-ET操作缓冲液10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05％vv表面活性剂P20，pH7.4中进行的解离10分钟。通过使用Scrubber2.0c曲线拟合软件将实时传感图与1:1结合模型拟合，测定动力学缔合ka和解离kd速率常数。由动力学速率常数计算结合解离平衡常数KD和解离半衰期t12如下：KD[M]＝kdka；以及t12min＝ln260*kd。结果汇总于表3中。表3：在37℃下人FcmAb的Biacore结合亲和力NB＝在所用条件下未观察到结合如表3中所示，本发明的所有抗GITR抗体都结合至人GITR，且若干抗体对于二聚体人GITR蛋白质展示次纳摩尔浓度sub-nanomolar的亲和力。此外，大部分抗GITR抗体还与食蟹猕猴GITR蛋白质展示出交叉反应性。未观察到与啮齿动物GITR蛋白质的交叉反应性数据未示出。实施例4.抗GITR抗体特异性且有效地结合至表达人GITR的细胞在本实施例中，使用基于电化学发光ECL的检测法测定抗GITR抗体特异性结合至表达人GITR的细胞系的能力。简单点说，通过脂染胺2000介导的方法，用人GITR氨基酸M1-V241，NCBI登录号#NP_004186.1，SEQID:413稳定转染人胚肾HEK-293-D9细胞。选择在完全生长培养基+G418中保持至少两周的转染株。对于细胞结合研究，将约1×105个hGITRHEK293-D9细胞或不表达人GITR的亲本HEK293-D9细胞接种至96孔碳电极板MULTI-ARRAY，MSD上，在37℃下保持1小时。在室温RT下，用2％BSAwv+PBS阻断非特异性结合位点1小时。接下来，在室温下，将范围从1.7pM至100nM的抗GITR抗体的连续稀释液添加至细胞中，保持1小时。接着，洗涤板以去除未结合的抗体AquaMax2000洗板机，MSDAnalyticalTechnologies并在室温下，用SULFO-TAGTM偶联的抗人κ轻链IgG抗体JacksonImmunoresearch检测结合板的抗体，保持1小时。洗涤之后，用SECTORImager6000MSD仪器记录发光信号。分析直接结合信号相对光单位，RLU随抗体浓度的变化并使用GraphPadPrismTM软件将数据与S形四参数逻辑斯蒂four-parameterlogistic剂量反应模型拟合。测定有关结合hGITRHEK293-D9细胞的EC50以指示各抗体的结合效力，EC50定义为检测到50％最大结合信号的抗体浓度。记录所检测到的100nM抗体结合至表达hGITR的细胞相对于亲本细胞的信号作为GITR结合强度和特异性的指示。结果汇总于表4中。如表4中所汇总，相对于亲本HEK293，大部分的本发明抗GITR抗体特异性结合至表达人GITR的细胞，且EC50范围是210pM至85nM。大部分的抗体以次纳摩尔浓度的EC50值结合至表达人GITR的细胞。同型对照抗体未展示出结合至表达hGITR的细胞系或亲本细胞系。表4：100nM抗GITR抗体与表达人GITR的细胞的结合EC50和结合强度总体而言，本实施例展示了本发明的抗GITR抗体展现出能与表达人GITR的细胞系特异性且有效的结合。实施例5.在NF-κB荧光素酶报告子分析中抗GITR抗体在FcγR抗体锚定存在或不存在下作为部分阻断剂和部分活化剂在本实施例中，通过基于荧光素酶的报告子分析评估了抗GITR抗体在存在或不存在抗体锚定至Fcγ受体FcγR情况下活化hGITR或阻断hGITR配体hGITRL介导的受体刺激作用的能力。简单点说，对稳定并入hGITR和NF-κB依赖性荧光素酶报告子的Jurkat细胞系进行工程改造hGITRJurkatNF-κBLuc。使用CignalLenti报告子系统SABiosciences将NF-κB荧光素酶报告子引入Jurkat细胞中。在HEK293T17中，利用Lenti-X慢病毒表达系统Clontech产生表达hGITR的慢病毒。用表达hGITR的慢病毒，通过聚凝胺介导的转导来转导JurkatNF-κB-Luc细胞并在500μgmlG418中保持2周进行筛选。对于抗体锚定研究，如上文所描述，用表达FcγRI的慢病毒转导HEK293细胞。先评估在无FcγR锚定存在下非锚定生物分析形式的抗hGITR抗体的活化和阻断特性。将约4×104个JurkatNF-κBLuchGITR细胞接种于涂覆PDL的96孔板中的OptiMEM+0.5％FBS中过夜ON。为了测定抗体活化能力，在37℃下，将细胞与浓度范围从0.5pM至100nM的连续稀释的抗hGITR抗体或hGITRL一起培育6小时。为了评估抗体对hGITRL介导的受体刺激作用的阻断，将细胞与连续稀释的抗hGITR抗体0.5pM至100nM一起预培育30分钟，随后与恒定剂量的10nMhGITRL一起培育6小时。接下来，测定在FcγR锚定存在下锚定生物分析形式的所选抗hGITR抗体的活化和阻断特性。与上述类似，将2.5×104个JurkatNfκBLuchGITR细胞接种于涂覆PDL的96孔板中的完全生长培养基中。为了评估抗体活化，在37℃下，将细胞与连续稀释的抗hGITRmAb或hGITRL0.5pM至100nM一起预培育1小时。接着，将1×104个hFcγR1HEK293细胞立即添加至各孔中，随后培育6小时。为了评估阻断，将hGITRJurkatNfκBLuc细胞与连续稀释的抗hGITR抗体0.5pM至100nM一起预培育1小时。将1×104个hFcγR1HEK293细胞添加至各孔中，随后添加10nM恒定剂量的hGITRL。对于锚定和非锚定的生物分析形式，用Oneglow试剂Promega测量荧光素酶活性并在Victor光度计PerkinElmer上测量相对光单位RLU。使用GraphPadPrism，由四参数逻辑斯蒂方程在12点反应曲线上测定EC50IC50值。结果汇总于表5和表6中。为了测定阻断％，用由处理过的孔得到的相对光单位RLU减去由未处理孔得到的背景RLU，并根据下式计算阻断百分比：[100-在最大剂量下的抗体RLU恒定配体剂量RLU]*100]。活化％是根据下式计算：归一化的mAbRLU最大GITR配体反应*100；归一化的mAbRLU是通过用由处理过的孔得到的RLU减去由未处理孔得到的RLU测定。平均活化倍数计算如下：在最大抗体剂量下的RLU由未处理孔得到的背景RLU。表5：抗GITR抗体在无FcγR锚定存在下的阻断和活化特性NB＝无阻断作用NA＝无活化作用如以上表5和以下表6中所汇总，测试抗体在非锚定和锚定生物分析形式中展现出部分活化和部分阻断特性。在非锚定形式中，抗体以范围从0.4nM至2.5nM的EC50介导受体刺激作用。若干抗体，如H4H14475P和H4H14491P是GITR受体的强效活化剂，分别展现出70％和60％的活化作用。大部分的测试抗体还展现出出对hGITRL介导的受体刺激作用的阻断，其IC50范围从0.6nM至3.8nM。若干示例性抗体，如H1H14512P和H4H14536P2分别展现出100％和90％的强效阻断活性。作为最强效的活化剂，H4H14475P在阻断分析中展现出最低活性——阻断百分比：-2％。表6：抗GITR抗体在FcγR锚定存在下的阻断和活化特性选定的在FcγR锚定生物分析形式中的测试抗体也展现出一系列活化和阻断特性。在非锚定形式中，作为最强活化剂的H4H14475P在锚定生物分析中也有效地活化hGITR，且相对于基础信号的活化倍数是8.0。非锚定阻断形式中的强阻断剂，如H1H14512P和H4H14536P2，在锚定分析中也展现了强效阻断作用阻断百分比：60％和70％。总体而言，结果展示了在改造的生物分析中，本发明的抗GITR抗体在无FcγR锚定存在下展现出强效GITR活化特性以及阻断GITRL介导的受体刺激作用的能力。示例性抗体，如H4H14775P和H4H1536P2也分别在FcγR锚定存在下维持其活化和阻断特性。实施例6.在初始人CD4+T细胞增殖分析中抗GITR抗体H4H14536P2在FcγR锚定存在和不存在下展现出强效活性如上文所描述，在改造的生物分析中测试抗GITR抗体在锚定Fcγ受体FcγR存在或不存在下活化hGITR的能力。在本实施例中，在初始人CD4+T细胞增殖主要生物分析中评估抗体锚定对hGITR活化的影响。人CD4+T细胞系统的优势在于，GITR拷贝数处于内源水平，而改造过的系统利用了GITR拷贝数较高的细胞。先测试抗GITR抗体在结合板的抗CD3存在下的CD4+T细胞增殖能力。简言之，使用人CD4+T细胞富集混合液StemcellTechnologies从健康供体白细胞团leukopack分离出人CD4+T细胞。利用MACSMiltenyiBiotech，通过耗尽CD45RO+细胞进一步富集初始T细胞。将约5×104个T细胞涂铺至预先涂覆次佳剂量的抗CD3mAbOKT330ngmL和调定量的抗GITR抗体或对照物的96孔U形底聚苯乙烯板上。刺激后三天，将氚化胸苷每孔1μCi，PerkinElmerHealthSciencesNET027001添加至各微孔中并脉动18小时。使用Filtermate收集器PerkinElmerHealthSciencesD961962将细胞收集至过滤板Unifilter-96GFC6005174上。将闪烁液PerkinElmerHealthSciencesMicroscint206013621添加至过滤板上并使用读板仪PerkinElmerHealthSciencesTopcountNXT测量放射性计数。相对于对照，T细胞增殖情况呈现于表7中，并提供了在10.6nM抗体浓度下的平均活化倍数。在这一分析形式中，10.6nM表示T细胞增殖在剂量反应曲线上达到稳定水平的点。表7：10.6nM结合板的抗GITR抗体在结合板的抗CD3Ab存在下的T细胞增殖活性活化倍数表7中的结果显示，在结合板的抗CD3存在下，测试的抗GITR抗体当结合板时展示了T细胞增殖能力。抗GITR对照AbI展示了超出同型对照27倍的增殖活性。大部分的本发明抗GITR抗体展示了超出同型对照2-8倍的活化作用，且若干示例性抗体H4H14469P、H4H14539P2和H4H14536P2分别展示了超出对照物12倍、13倍和23倍的活化作用。总体而言，结果展示了测试的抗GITR抗体在这一经典形式中展示出T细胞增殖活性。接下来，采用另外的分析形式测试在细胞表面结合的FcγR存在或不存在的情况下抗GITR抗体活化T细胞的能力。为了评估在FcγR1锚定存在的情况下抗GITR抗体活化T细胞的能力，如上文所描述，对HEK293细胞进行改造以表达高亲和力hFcγR1受体。在37℃下，用50μgmL丝裂霉素C处理HEK293FcγRI细胞30分钟以抑制增殖。在随后洗涤以去除痕量的丝裂霉素C之后，用300ngmL抗CD3抗体OKT3涂覆细胞以刺激T细胞活化。将HEK293FcγRI细胞与初始人CD4+T细胞以1:2比率共培养并将调定量的抗GITR抗体或对照物添加至共培养用培养基中。通过测量氚化胸苷的并入量来评估T细胞增殖。刺激之后72小时，将氚化胸苷每孔0.5μCi，PerkinElmerHealthSciences添加至各微孔中，在37℃下再保持18小时。使用Filtermate收集器PerkinElmerHealthSciencesD961962将细胞收集至过滤板Unifilter-96GFC6005174上。将闪烁液PerkinElmerHealthSciencesMicroscint206013621添加至过滤板上并使用读板仪PerkinElmerHealthSciencesTopcountNXT测量放射性计数。相对于对照，T细胞增殖情况呈现于表8中，并提供了在33nM抗体浓度下的平均活化倍数。在这一分析形式中，33nM表示T细胞增殖在剂量反应曲线上达到稳定水平的点。表8：33nM抗GITR抗体在FcγR锚定存在下的T细胞增殖活性活化倍数表9：33nM抗GITR抗体在FcγR锚定存在下的T细胞增殖活性EC50如表8中的结果所汇总的，若干抗体了显示超出对照物1-2倍的活化作用。然而，一种示例性抗体H4H14536P2在锚定情况下展示了强效T细胞增殖活性。以5.5倍的平均活化倍数，H4H14536P2对于T细胞活化的刺激作用强于抗GITR比较抗体平均活化倍数范围：0.7-2.0。与最强效的抗GITR对照Ab对照I-mIgG的34.1nM对比表9，H4H14536P2针对T细胞增殖的平均EC50是3.2nM。此外，在这一分析形式中，在上述改造的生物分析中作为强效活化剂的H4H14475P在这一主要生物分析情况下展示了适当的增殖活性。接下来，测试抗体在无FcγR锚定存在下的T细胞增殖活性。如上文所描述，分离出人CD4+T细胞，并将其涂铺至预先涂覆30ngmL抗CD3抗体OKT3的96孔U形底聚苯乙烯板上。与上述类似，将调定浓度的抗GITR抗体或对照物添加至培养基中。通过氚化胸苷的并入量来测量T细胞增殖情况。在22nM抗体浓度下，于四个供体中观察到的T细胞增殖以相较于同型对照的活化倍数呈现于表10中。H4H14536P2的EC50nM显示于表11中。如在锚定分析形式中所观察到的，H4H14536P2在22nM下于非锚定形式中也展示了强效T细胞增殖活性。H4H14536P2以11.0的平均活化倍数和8.3nM的EC50活化T细胞。在这一分析形式中，对照抗GITR抗体I未展现出T细胞增殖能力。表10：22nM抗GITR抗体在无FcγR锚定存在下的T细胞增殖活性活化倍数表11：H4H14536P2的EC50nM总体而言，本实施例展示了一种示例性抗GITR抗体H4H14536P2在hFcγR1锚定存在和不存在下都展示出强效T细胞增殖活性，而抗GITR比较抗体对照I在非锚定情况下未展示出T细胞增殖活性。因此，H4H14536P2在无hFcγR1锚定存在下活化T细胞的能力是一种独特的特性，意味着所述抗体在体内不会与内源性IgG竞争结合至Fcγ受体以保持活性。H4H14536P2的这一独特的特性可以在治疗情况下提供优势。实施例7.施用抗GITR抗体与抗PD1抗体的组合协同控制和根除肿瘤使用以下方法评估施用抗GITR抗体与抗PD1抗体的组合对肿瘤生长的影响。评估结果概述如下。肿瘤植入、治疗方案和生长测量将MC38结肠直肠癌细胞从ATCC获得皮下植入C57BL6小鼠3×105个细胞小鼠中指定为第0天。第6天即，肿瘤植入后6天，将小鼠分成4组每组5只小鼠，并用以下各物经腹膜内IP处理各组：1大鼠IgG2a2A3，BioXcell，目录号BE0089同型对照+大鼠IgG2bLTF2，BioXcell，目录号BE0090同型对照；2抗GITR单克隆抗体DTA1大鼠抗小鼠GITR，BioXcell，目录号BE0063+大鼠IgG2a对照；3抗PD-1单克隆抗体RPM1-14大鼠抗小鼠PD-1，BioXcell，目录号BE0146+大鼠IgG2b对照；或4抗GITR抗体DTA1+抗PD-1抗体RPM1-14。接着，在第13天再施用抗体注射液。以各抗体5mgkg的剂量进行抗体治疗。在两个维度上测量肿瘤长度×宽度并计算肿瘤体积长度×宽度2×0.5。当肿瘤达到指定肿瘤指标肿瘤体积＞2000mm3或肿瘤溃疡时，对小鼠实施安乐死。肿瘤再攻击评估在右侧腹中用3×105个同基因肿瘤MC38并在左侧腹中用2.5×105个同种异体B16F10.9肿瘤细胞系黑素瘤细胞系，ATCC再攻击用抗PD-1抗体与抗GITR抗体的组合治疗的已保持无肿瘤超过80天的小鼠。如上文所描述，监测肿瘤。抗体耗尽实验用组合疗法或同型对照IgG治疗小鼠，所述小鼠从肿瘤攻击前一天开始注射不同的清除型mAb抗CD4、抗CD8、抗CD25且每周两次给与，总计八次剂量。耗尽效率是通过对末梢血液样品进行FACS分析来确定。关于肿瘤内淋巴细胞的流式细胞术FACS分析如上文所描述，对小鼠进行治疗。抗体治疗之后五天，收集肿瘤和脾。用剪刀切碎肿瘤，并用LiberaseTLDNA酶I混合物使其解离以形成单细胞悬浮液。用gentleMACSOcto解离器解离脾。用针对小鼠CD45、CD3、CD4、CD8、CD25和FoxP3的数组FACS抗体以及活化标记物PD1、GITR、Ki67、CD160、CTLA4、ICOS、TIM3、LAG3、KLRG1和CD44对细胞染色。将细胞采集于BDFortessaX20或LSRII上并通过FlowJo软件进行分析。在带有MC38的小鼠中施用抗小鼠GITR抗体与抗小鼠PD1抗体的组合明显诱导了肿瘤消退并提供长期肿瘤缓解使用上文所描述的方法，评估施用抗小鼠GITR抗体克隆DTA-1，BioXcell，目录号BE0063与抗小鼠PD-1抗体克隆RMP1-14，BioXcell，目录号BE0146的组合在控制皮下MC38肿瘤方面的功效。如图1以及表12和13中所示，相较于单独使用抗PD-1或抗GITRmAb、或同型对照治疗的小鼠，PD1阻断和抗GITRDTA-1抗体的组合在治疗带有MC38肿瘤的小鼠时明显地诱导肿瘤消退。此外，用组合疗法治疗的小鼠显示长期肿瘤缓解，因为100％的小鼠保持超过120天无肿瘤图2、表14、15。表12.在抗GITR和或抗PD-1Ab治疗之后各治疗组的平均肿瘤体积mm3±SEM和无肿瘤小鼠表13.在抗GITR和或抗PD1Ab治疗之后三个独立实验中的无肿瘤小鼠的概述表14.存活比例百分比施用抗小鼠GITR抗体与抗小鼠PD1抗体的组合诱导肿瘤抗原特异性免疫记忆反应为了确定通过组合施用抗PD-1和抗GITR抗体治疗的小鼠是否产生肿瘤抗原特异性记忆反应，在右侧腹中用3×105个同基因MC38结肠癌细胞并在左侧腹中用2.5×105个同种异体黑素瘤细胞系B16F10.9再攻击存活的无肿瘤小鼠。已发现，MC38肿瘤在用抗PD1抗体和抗GITR抗体组合治疗的小鼠中并不生长，而这些肿瘤在未处理的对照小鼠无任何先前治疗中生长图3。相比之下，同种异体肿瘤黑素瘤在这两组中都不生长，表明组合施用抗PD-1和抗GITR抗体诱导肿瘤抗原特异性免疫记忆反应，能够控制用相同类型肿瘤进行的第二次攻击。免疫群体研究用CD4、CD8和CD25清除型mAb治疗小鼠，随后进行抗PD-1抗体和抗GITR抗体组合治疗。已发现，CD8+细胞的耗尽使抗肿瘤作用完全消除MC38肿瘤，而耗尽CD4或CD25T细胞则仍显示出部分抑制作用图4、表15。因此，组合疗法在MC38肿瘤中的抗肿瘤作用主要取决于CD8+T细胞。评估抗GITR和抗PD1组合治疗对肿瘤浸润性淋巴细胞TIL的影响。已发现，相较于单药疗法治疗抗PD-1或抗GITR或同型对照，所述组合治疗诱导CD8Treg比率明显增加图5。所述组合治疗对CD4Treg比率的影响不太明显。抗PD-1和抗GITR组合治疗使肿瘤内Treg的百分含量降低，而使CD8T细胞增加图6。另外，相较于同型对照治疗的小鼠，单独抗PD-1治疗诱导Treg细胞数量增多，而抗PD-1抗GITR组合治疗使Treg细胞数量明显减少。表15.在CD4、CD8或CD25耗尽之后的抗肿瘤功效在带有MC38的GITRGITRL人源化小鼠中施用抗人GITR抗体与抗小鼠PD1抗体的组合明显诱导了肿瘤消退并提供长期肿瘤缓解评估在GITRGITRL人源化小鼠中施用抗人GITR抗体H2aM14536P2与抗小鼠PD-1抗体克隆RMP1-14BioXcell，目录号BE0146的组合在控制皮下MC38肿瘤方面的功效。已发现，如平均肿瘤生长曲线中所示图7、表16，在带有MC38肿瘤的小鼠中，与单独抗PD117或抗GITR17mAb、或同型对照07治疗的小鼠比较，抗小鼠PD-1阻断与抗人GITR抗体协同作用并明显诱导肿瘤消退46只小鼠。另外，与同型对照的0％和抗PD-1或抗GITR治疗组的10％相比图8、表16，用组合疗法治疗的小鼠显示了长期肿瘤缓解，如超过60％的小鼠在第50天时保持无肿瘤。抗人GITR抗体使肿瘤内CD8Treg比率增加评估抗人GITR抗体对肿瘤内和脾T细胞群的影响。评价抗人GITR抗体H2aM14536P2和H1H14536P2。已发现，两种抗人GITR抗体同型mIg2a和hIgG1诱导肿瘤内CD8Treg比率明显增加图9。所述治疗对周围脾T细胞亚群无影响。在本分析中使用人IgG1和小鼠IgG2a同型IgG作为对照。表16.由抗人GITR抗体和抗小鼠PD1抗体治疗介导的抗肿瘤功效在带有MC38的PD1PDL1人源化小鼠中施用抗小鼠GITR抗体与抗人PD1抗体的组合明显诱导了肿瘤消退并提供长期肿瘤缓解评估在PD1PDL1人源化小鼠中施用抗小鼠GITR抗体DTA1与抗人PD-1抗体如美国专利公开第20150203579号中所公开的REGN2810，又称为H4H7798N的组合在控制皮下MC38肿瘤方面的功效。已发现，如平均肿瘤生长曲线中所示图10、表17，在带有MC38肿瘤的小鼠中，相较于单独抗PD1或抗GITRmAb、或同型对照治疗的小鼠，抗人PD-1阻断与抗小鼠GITR抗体协同作用并诱导肿瘤生长延迟。另外，与同型对照、抗PD-1或抗GITR治疗组的0％相比图11，用组合疗法治疗的小鼠显示了长期肿瘤缓解，如超过40％的小鼠在第45天时保持无肿瘤。表17.由抗小鼠GITR+抗人PD1Ab治疗介导的抗肿瘤功效实施例8：RNA提取和分析单细胞分选RNA-Seq分析在肿瘤攻击后第8天和第11天，利用小鼠肿瘤解离试剂盒特拉华州贝尔吉施格拉德巴赫BergischGladbach,DE的MiltenyiBiotec制备肿瘤的单细胞悬浮液并用gentleMACSTMOcto解离器MiltenyiBiotec解离脾。汇集来自同一治疗组的肿瘤和脾并利用FACS分选存活的CD8+T细胞。将FACS分选的T细胞与C1细胞悬浮试剂加利福尼亚州南旧金山SouthSanFrancisco,CA的Fluidigm混合，随后将其装载至5至10μm的C1集成射流电路IFC；Fluidigm上。通过将2.5μL乙锭均二聚体-1和0.625μL钙黄绿素AM加利福尼亚州卡尔斯巴德Carlsbad,CA的LifeTechnologies添加至1.25mLC1细胞洗涤缓冲液Fluidigm中来制备活死细胞染色溶液LIVEDEADstainingsolution并将20μL该溶液装载至C1IFC上。在Zeiss显微镜的亮视野、GFP和德克萨斯红通道中小心地检查每个捕捉位点的细胞双联体和活力。根据制造商的说明方案100-7168E1，在C1单细胞自动制备IFCSingle-CellAutoPrepIFC上进行细胞溶解、逆转录和cDNA扩增。使用SMARTerTMUltraLowRNA试剂盒加利福尼亚州山景城MountainView,CA的Clontech，由单一细胞合成cDNA。根据制造商的推荐方案100-7168E1，使用NEXTERAXTDNA样品制备试剂盒Illumina构建IlluminaNGS文库。在IlluminaNextSeq加利福尼亚州圣地亚哥SanDiego,CA的Illumina上，通过多路复用单端测序single-read操作对总计2,222个单细胞进行测序，共75个循环。通过IlluminaCASAVA1.8.2将原始序列数据BCL文件转化成FASTQ格式。基于条形码对读段进行解码。使用FastQCwww.bioinformatics.babraham.ac.ukprojectsfastqc评价读段质量。实施例9：CD226和TIGIT在组合治疗中的作用在一些实验中，CD226的基因失活或药理学抑制作用使抗GITR抗PD1组合治疗介导的肿瘤消退逆转，而其它TNF受体或B7超家族成员的抑制作用没有影响。CD226阻断实验在肿瘤攻击后第5天和在免疫疗法前一天，腹膜内i.p.注射0.5mg抗CD22610E5，加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience或大鼠IgG2b同型对照IgGLTF2，BioXCell，新罕布什尔州西黎巴嫩WestLebanon,NH。使用数字卡尺VWR，宾夕法尼亚州的拉德诺Radnor,PA，每周2-3次摸索地测量垂直肿瘤直径。使用公式L×W×0.5计算体积，其中L是最长尺寸并且W是垂直尺寸。利用卡普兰-迈耶法Kaplan-Meiermethod测定每组的存活率差异，并通过对数秩检验，使用第6版PRISM加利福尼亚州拉荷亚LaJolla,CA的GraphPadSoftwareInc.的存活率分析计算总体P值。当肿瘤负荷达到方案指定大小的最大肿瘤体积2000mm3时，其被定义为死亡，以使发病最小化。在利用抗GITR+抗PD-1或同型Ab的免疫疗法治疗前一天，用CD226阻断Ab或同型Ab对照IgG治疗带有MC38肿瘤的小鼠，如图12和13，示出了平均肿瘤生长曲线图12和平均肿瘤存活率曲线图13。数据代表三个实验，n＝5只小鼠组，利用对数秩检验进行存活率分析。用MC38肿瘤攻击野生型或TIGITKO小鼠，用抗CD226或对照IgG治疗并接受同型对照图14或抗GITR+抗PD-1组合疗法图15。显示的数据为代表了两个实验的平均肿瘤生长曲线n＝4-5只小鼠组。使用CD226阻断mAb，结果显示，由组合治疗介导的抗肿瘤免疫需要通过CD226进行共刺激信号传导。此外，增进TIGITKO小鼠中的肿瘤监视需要CD226信号传导通路图14和15。来自组合治疗样品的CD8+T细胞中的RNA特征为了鉴别以克隆方式扩增的来自组合治疗样品的CD8+T细胞在第11天收集的肿瘤中特有的基因特征，对不同治疗组进行全面比较。将在以克隆方式扩增的来自组合疗法的CD8+T细胞中上调的基因与来自同型治疗的CD8+T细胞或未扩增的来自组合治疗的CD8+T细胞中上调的基因相比较。热定位分析鉴别出在所述比较内重叠的三十个基因。在抗GITR抗PD1组合治疗肿瘤之后，在扩增的CD8T细胞群内观察到30个基因的RNA特征变化≥2倍p＜0.01。这30个基因包含Id2、S100a11、Ndufb3、Serinc3、Ctsd、S100a4、Ppp1ca、Lbr、Peli1、Lcp2、Ube2h、Cd226、Mapkapk3、Racgap1、Arf3、Mki67、Ergic2、Azi2、Dync1i2、Sik1、Pde4d、Ppp3cc、Nek7、Emc4、Vav1、Dock10、Tmem173、Fam3c、Ppp1cc及Glud1。接下来进行全部五个组即，i同型治疗、ii抗GITR的扩增的CD8、iii抗GITR抗PD1组合的扩增的CD8、iv抗PD1的扩增的CD8以及v抗GITR抗PD1组合的未扩增的CD8的四元比较以鉴别出相对于单药疗法治疗，组合疗法特异性调控的基因。在四元分析中鉴别两个重叠的上调基因p＜0.01，表达量的倍数变化≥2。作为在抗肿瘤反应中起到重要作用的共刺激分子，CD226被鉴别为不同比较对共有的两个基因之一。对所有治疗组即，i同型、ii抗GITR、iii抗PD-1和iv抗GITR抗PD1组合中不同肿瘤内CD8+T细胞亚群a总细胞、b以克隆方式扩增的细胞或c未扩增的细胞的表达分析披露，通过对以克隆方式扩增的T细胞进行组合治疗，使得CD226mRNA含量明显增加倍数变化＝10.7，但这一差异在整体细胞倍数变化＝3.5和未扩增的CD8+T细胞不显著中被稀释。另外，通过对以克隆方式扩增的CD8T细胞进行组合治疗，使得CD226mRNA含量相较于抗PD-1倍数变化＝6.5和抗GITR倍数变化＝9.2显著增加图16。PD1与CD226之间的关联接下来研究PD1与CD226分子之间的潜在关联。为了检查CD226是否是PD1-Shp2复合物脱磷酸化的靶，发明人在无细胞大单膜泡LUV系统中重构涉及T细胞信号传导的不同组分即，CD3、CD226、胞质酪氨酸激酶Lck、Zap70、SLP7652和PI3Kp85a。通过磷酸酪氨酸pY免疫印迹测量各组分对LUV的PD-1滴定的敏感性图17。由此确定，TCRCD3ζ不是PD-1-Shp2脱磷酸化的靶，而在30分钟治疗之后，PD1-Shp2以剂量依赖性方式使CD226高效脱磷酸化图17。这一数据展示了PD-1与CD226之间的关联。接下来，在临床环境中研究PD-1抑制与CD226表达之间的关系。对在PD-1靶向治疗前后从43名晚期癌症患者收集的肿瘤活组织切片进行RNA-Seq分析。在两剂抗hPD-1治疗之后，癌症患者中的CD226表达明显增加图22。另外，询问来自癌症基因组图谱TheCancerGenomeAtlas，TCGA的临床数据以检查CD226表达量是否与总体T细胞活化强度相关并且可以预测癌症患者有较好的预后。实际上，具有高基线CD226表达的患者在所评价的二十种不同类型癌症皮肤黑素瘤、肺腺癌、头颈部鳞状癌、子宫体子宫内膜癌、肉瘤、直肠腺癌、乳房侵袭性癌瘤、肾脏肾透明细胞癌、子宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌、多形性胶质母细胞瘤、结肠腺癌、胃腺癌、膀胱尿道上皮癌、甲状腺癌、前列腺腺癌、胰腺癌、脑低恶性度神经胶质瘤、肺鳞状细胞癌、肾脏肾乳头状细胞癌和卵巢浆液性囊腺癌中的五种皮肤黑素瘤、肺腺癌、头颈部鳞状癌、子宫体子宫内膜癌瘤和肉瘤中具有显著较高的存活概率。总体来说，这些结果支持免疫疗法策略，该策略增进CD226信号传导，同时阻断TIGIT例如通过抗GITR治疗，实现最大T细胞活化。CD226的基因失活使用CD226阻断mAb，结果显示，由组合治疗介导的抗肿瘤免疫需要通过CD226进行的共刺激信号传导图12、13。由于CD226Ab可能对CD8T细胞亚群具有潜在耗尽作用，故使C57BL6背景小鼠体内的CD226基因失活以确定所述结果。CD226--小鼠显示对T细胞CD4+、CD8+、Treg动态平衡无缺陷图18A-18D，并且针对TCR活化的反应类似于野生型小鼠图18E-18I。据观察，所述组合治疗在CD226--小鼠中不再具有抗肿瘤作用或存活益处，表明了CD226是所观察到的所述组合的抗肿瘤作用所必不可少的图19A。CD226的作用是特有的，因为使用CTLA4-Ig抑制TNF受体超家族其它成员OX40L或4-1BBL或阻断B7共刺激分子CD28保留了由组合疗法介导的抗肿瘤作用图19B-19D。无TIGIT的动物需要CD226总的单细胞分选RNA-Seq和FACS表型数据显示，抗PD-1有利于CD226的表达，而抗GITR治疗下调TIGIT的表面表达，协同地恢复动态平衡的T细胞功能。已显示，增进TIGIT--小鼠中的肿瘤监视需要CD226信号传导通道图14、15。此外，相较于MC38-空白载体MC38-emptyvector,MC38-EV肿瘤细胞或用同型对照治疗的小鼠，带有过度表达CD155PVR6CD226的主要配体的MC38肿瘤细胞的小鼠在抗PD-1或抗GITR或组合疗法治疗后，其肿瘤生长显著延迟图20。由移植了MC38-CD155的小鼠的免疫图谱分析确定，在植入后，MC38-CD155细胞上CD155的表达量持续高于M38-EV空白载体。已发现，MC38肿瘤细胞上CD155的过度表达与CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞上可检测的CD226表达的减少有关图21A，同时如由肿瘤内T细胞上IFNγ图21B和4-1BB图21C的表达增加所指示，MC38肿瘤细胞上CD155的过度表达增进T细胞活化。在周围未观察到影响。不受任何理论限制，假设CD226表达量应当与总体T细胞活化强度相关，并且可以预测癌症患者有较好的预后。实际上，具有高CD226表达的患者在三种类型的癌症皮肤黑素瘤、肺腺癌和肉瘤中具有显著较高的存活概率。这些数据支持了免疫疗法策略，该策略增进CD226信号传导，同时阻断TIGIT，实现了最大T细胞活化。前述实验展示了施用抗GITR抗体与抗PD1抗体的组合的协同作用。另外，具体地说，以上实验展示，组合施用抗GITR抗体和抗PD1抗体诱导肿瘤消退，提供长期肿瘤缓解并且诱导肿瘤抗原特异性免疫记忆反应。实施例10：TCR分析对于TCR分析，发明人开发出新生物信息学流程rpsTCR，用于从随机引发的短RNA测序读段中重构和提取TCR序列，尤其是TCR-CDR3序列。rpsTCR获得双端和单端短读段并使用TopHat《生物信息学Bioinformatics》25,1105-11112009及默认参数将这些读段定位至小鼠或人基因组和转录组，但无法定位TCR基因座和转录物。丢弃定位的读段并使未定位的读段再循环以提取TCR序列。修减未定位读段中的低质量核苷酸。接着，使用HTQC工具包《生物信息学》14,332013滤出长度小于35bp的读段。使用iSSAKE《生物信息学》25,458-4642009默认设置将通过QC的短读段组装成较长读段。使用TCRklass《免疫学杂志JImmunol》194,446-4542015默认值从1.7至2的Scr保守残基支持分数设置鉴别CDR3序列。使用由健康人PBMC样品得到的靶向TCR-seq数据作为阳性对照以评价在所述流程中引入额外步骤是否引起比单独TCRklass高的假阳性率或假阴性率。利用rpsTCR和TCRklass检测来自TCRB64,031或TCRA51,448的大部分特有CDR3序列。对于TCRB-CDR3和TCRA-CDR3，rpsTCR与TCRklass之间的平方相关性分别是0.9999和0.9365。使用六种TCR阴性癌症或非癌症细胞系作为阴性对照。rpsTCR未检测到CDR3序列，而TCRklass从一些TCR阴性癌症细胞系中提取出一些CDR序列。为了进一步验证目标流程的性能，使用靶向TCR-seq和随机引发RNA-Seq方法200M，2×100bp对健康小鼠PBMC样品进行测序。尽管由RNA-Seq数据组装的CDR3序列的数量比由靶向TCR-seq方法组装的序列的数量少得多，但使用rpsTCR从RNA-Seq数据鉴别出的CDR3序列中有约45％在由靶向TCR-seq得到的CDR3序列中也观察到。由于靶向TCR-seq存在技术限制，从RNA-Seq数据提取的CDR3序列中有一部分不存在于TCR-seq结果中也在意料之中。例如，用于靶向TCR-seq的5'race接头的效率一般较低，并且多重PCR往往会高频率扩增TCR，因此只能靶向一小部分的TCR。正如预期的，使用rpsTCR从RNA-Seq数据鉴别的明显较高百分比的CDR3序列约70％在由靶向TCR-seq得到的高频CDR3序列＝0.1％中也观察的到，而使用单独TCRklass仅提取到约40％。此外，切割100bp长度的读段为长50bp的片段并随机地选择200M读段。在利用靶向TCR-seq方法排序的前10个CDR3序列中，利用rpsTCR检测到8个CDR3序列，而利用TCRklass仅检测到3个。接着，应用rpsTCR流程，从由不同抗体治疗的MC38的肿瘤内CD8T细胞产生的单细胞RNA-Seq数据提取CDR3序列。CDR3_β和CDR3_α序列检测率与使用靶向TCR-seq方法得到的公开数据相当，以检测由T细胞的单细胞测序得到的TCR序列。本发明的范围不应受本申请所描述的具体实施方式限制。实际上，除了本申请所描述的内容之外，本领域的技术人员根据前述说明和附图将显而易知本发明的各种修改。这些修改旨在属于本申请权利要求书的范围内。序列表瑞泽恩制药公司抗GITR抗体及其用途238811-34.410206WO0162348,3532016-06-1062500,3122017-05-0262432,0232016-12-0962256,9222015-11-18413PatentIn第3.5版1369DNA人工序列合成1caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagttatggcatggactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatcctggaagtaataaatactat180gcagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagacgga300gaactgggactggactactactccggcatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc360gtctcctca3692123PRT人工序列合成2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530GlyMetAspTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpTyrProGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrValSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspGlyGluLeuGlyLeuAspTyrTyrSerGlyMetAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSer115120324DNA人工序列合成3ggattcaccttcagtagttatggc2448PRT人工序列合成4GlyPheThrPheSerSerTyrGly15524DNA人工序列合成5atatggtatcctggaagtaataaa2468PRT人工序列合成6IleTrpTyrProGlySerAsnLys15748DNA人工序列合成7gcgagagacggagaactgggactggactactactccggcatggacgtc48816PRT人工序列合成8AlaArgAspGlyGluLeuGlyLeuAspTyrTyrSerGlyMetAspVal1510159321DNA人工序列合成9gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60atcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaaactggtatcagcagaaacca120gggaaagcccctaagcgcctgatcaatggtgcatccagtttgcaaagtggggtcccatca180aggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcct240gaagattttgcaacttattactgtctacaacttaatagttaccctcggacgttcggccaa300gggaccaaggtggaaatcaaa32110107PRT人工序列合成10AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnGlyIleArgAsnAsp202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysArgLeuIle354045AsnGlyAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysLeuGlnLeuAsnSerTyrProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys1001051118DNA人工序列合成11cagggcattagaaatgat18126PRT人工序列合成12GlnGlyIleArgAsnAsp15139DNA人工序列合成13ggtgcatcc9143PRT人工序列合成14GlyAlaSer11527DNA人工序列合成15ctacaacttaatagttaccctcggacg27169PRT人工序列合成16LeuGlnLeuAsnSerTyrProArgThr1517369DNA人工序列合成17caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagcaactatggcatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatcctggaagtaataagttctat180acagactccgtggagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtatat240ctacaaatggacagcctgagagccgaagacacggctgtgtattactgtgcgagagggggg300gcactgggggtagactattactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc360gtctcctca36918123PRT人工序列合成18GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnTyr202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpTyrProGlySerAsnLysPheTyrThrAspSerVal505560GluGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAspSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGlyGlyAlaLeuGlyValAspTyrTyrTyrGlyMetAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSer1151201924DNA人工序列合成19ggattcaccttcagcaactatggc24208PRT人工序列合成20GlyPheThrPheSerAsnTyrGly152124DNA人工序列合成21atatggtatcctggaagtaataag24228PRT人工序列合成22IleTrpTyrProGlySerAsnLys152348DNA人工序列合成23gcgagagggggggcactgggggtagactattactacggtatggacgtc482416PRT人工序列合成24AlaArgGlyGlyAlaLeuGlyValAspTyrTyrTyrGlyMetAspVal15101525321DNA人工序列合成25gccatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60ctcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaacca120gggaaagcccctaatttcctgatctattctgcatccagtttacaaagtggggtcccatca180aggttcagcggcagtggatctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctacagcct240gaggattttgcaacttattactgtctacaaaattacaattacccgtggacgttcggccaa300gggaccaaggtggaaatcaaa32126107PRT人工序列合成26AlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrLeuThrCysArgAlaSerGlnGlyIleArgAsnAsp202530LeuGlyTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProAsnPheLeuIle354045TyrSerAlaSerSerLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysLeuGlnAsnTyrAsnTyrProTrp859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys1001052718DNA人工序列合成27cagggcattagaaatgat18286PRT人工序列合成28GlnGlyIleArgAsnAsp15299DNA人工序列合成29tctgcatcc9303PRT人工序列合成30SerAlaSer13127DNA人工序列合成31ctacaaaattacaattacccgtggacg27329PRT人工序列合成32LeuGlnAsnTyrAsnTyrProTrpThr1533372DNA人工序列合成33caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgttgcgtctggattcaccttcagtgactatggcatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctagagtgggtggcagttatatggtatgaaggaagtaataaatattat180gcagactccgtgacgggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgttt240ctgcaaatgaacagtctgaaagccgaagacacggctgagtattattgtgcgaaagatggg300gggcagctcgcctaccagtattactacggcatggacgtctggggccaagggaccacggtc360accgtctcctca37234124PRT人工序列合成34GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerGlyPheThrPheSerAspTyr202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpTyrGluGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560ThrGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGlnMe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权利要求：1.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段展现出一种或多种选自以下组的特性：i在37℃下以小于约5.0nM的KD结合单体人GITR，所述KD由表面等离子体共振所测量；ii在37℃下以超过约12分钟的t12结合单体人GITR；iii在37℃下以小于约950pM的KD结合二聚体人GITR，所述KD由表面等离子体共振所测量；iv在37℃下以超过约7分钟的t12结合二聚体人GITR；以及v以小于约260pM的EC50结合人GITR转染的人胚肾293HEK-293D9细胞。2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段活化人GITR。3.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下活化人GITR。4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约3nM的EC50以及大于约25％的活化百分比活化人GITR，所述EC50和活化百分比由NFκB报告子分析所测定。5.根据权利要求3或4所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约1.0nM的EC50活化人GITR，所述EC50和活化百分比由NFκB报告子分析所测定。6.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下展现出T细胞增殖活性，所述活性在初始人CD4+T细胞增殖分析中测定。7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以约8nM或更小的EC50展现出T细胞增殖活性，所述活性在初始人CD4+T细胞增殖分析中测定。8.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在Fc锚定存在下活化人GITR。9.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在Fc锚定存在下展现出高出背景值至少约2倍的T细胞增殖活性，所述活性在初始人CD4+T细胞增殖分析中测定。10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在Fc锚定存在下，以小于约34nM的EC50展现出T细胞增殖活性，所述活性在初始人CD4+T细胞增殖分析中测定。11.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段阻断hGITR配体hGITRL介导的受体刺激作用。12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下阻断hGITRL介导的受体刺激作用。13.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在无Fc锚定存在下，以小于约4.0nM的IC50并以大于约54％的阻断百分比阻断hGITRL介导的受体刺激作用，所述IC50和阻断百分比由NFκB报告子分析所测定。14.一种结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：a具有如表1中所列的氨基酸序列的重链可变区HCVR的互补决定区CDR；和b具有如表1中所列的氨基酸序列的轻链可变区LCVR的CDR。15.根据权利要求14所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括具有如表1中所列的氨基酸序列的HCVR和具有如表1中所列的氨基酸序列的LCVR。16.根据权利要求14所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：iHCDR1结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:100、164、196、244、292、340和348；iiHCDR2结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:102、166、198、246、294、342和350；iiiHCDR3结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:104、168、200、248、296、344、352；ivLCDR1结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:108、172、204、252、300和404；vLCDR2结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:110、174、206、254、302和406，以及viLCDR3结构域，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQIDNO:112、176、208、256、304和408。17.根据权利要求14所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：i包含SEQIDNO:100的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:102的HCDR2；包含SEQIDNO:104的HCDR3；包含SEQIDNO:108的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:110的LCDR2；以及包含SEQIDNO:112的LCDR3；ii包含SEQIDNO:164的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:166的HCDR2；包含SEQIDNO:168的HCDR3；包含SEQIDNO:172的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:174的LCDR2；以及包含SEQIDNO:176的LCDR3；iii包含SEQIDNO:196的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:198的HCDR2；包含SEQIDNO:200的HCDR3；包含SEQIDNO:204的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:206的LCDR2；以及包含SEQIDNO:208的LCDR3；iv包含SEQIDNO:244的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:246的HCDR2；包含SEQIDNO:248的HCDR3；包含SEQIDNO:252的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:254的LCDR2；以及包含SEQIDNO:256的LCDR3；v包含SEQIDNO:292的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:294的HCDR2；包含SEQIDNO:296的HCDR3；包含SEQIDNO:300的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:302的LCDR2；以及包含SEQIDNO:304的LCDR3；vi包含SEQIDNO:340的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:342的HCDR2；包含SEQIDNO:344的HCDR3；包含SEQIDNO:404的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:406的LCDR2；以及包含SEQIDNO:408的LCDR3；或vii包含SEQIDNO:348的重链互补决定区HCDR-1；包含SEQIDNO:350的HCDR2；包含SEQIDNO:352的HCDR3；包含SEQIDNO:404的轻链互补决定区LCDR-1；包含SEQIDNO:406的LCDR2；以及包含SEQIDNO:408的LCDR3。18.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体竞争结合GITR，所述参照抗体包含选自以下组的HCVRLCVR氨基酸序列对：SEQIDNO:98106；162170；194202；242250；290298；338402；和346102。19.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体结合至GITR上的同一表位，所述参照抗体包含选自以下组的HCVRLCVR氨基酸序列对：SEQIDNO:98106；162170；194202；242250；290298；338402；和346102。20.一种药物组合物，包括权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载剂或稀释剂。21.一种用于治疗受试者的癌症的方法，包括施用权利要求20所述的组合物。22.一种调节受试者的抗肿瘤免疫反应的方法，包括向所述受试者施用权利要求1至19中任一项所述的结合GITR的抗体或其抗原结合片段。23.根据权利要求20所述的方法，还包括施用结合至另一种T细胞活化受体的抗体或其抗原结合片段。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述T细胞活化受体是CD28、OX40、CD137、CD27或HVEM。25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，还包括施用结合至T细胞抑制性受体的抗体或其抗原结合片段。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述T细胞抑制性受体是CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3。27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用放射疗法。28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，还包括施用一种或多种化学治疗剂。29.根据权利要求26所述的方法，其中所述T细胞抑制性受体是PD1。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述结合至T细胞受体的抗体是REGN2810。31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述结合GITR的抗体是权利要求17所述的抗体。

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