申请/专利权人：亘喜生物科技(上海)有限公司

申请日：2017-08-30

公开（公告）日：2023-04-28

公开（公告）号：CN109789164B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;A61K35/17;C07K16/28;C12N15/62

优先权：["20160830 US 62/381,418"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.04.28#授权;2019.06.14#实质审查的生效;2019.05.21#公开

摘要：本发明涉及嵌合抗原受体CAR融合蛋白，其包含从N末端到C末端：i单链可变片段scFv，包含VH和VL，其中scFv结合肿瘤抗原，ii跨膜结构域，iiiGITR胞内结构域的共刺激结构域，和iv激活结构域。在一个实施方式中，肿瘤抗原是人表皮生长因子受体EGFR、人间皮素或人CD19。具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的CAR具有优于其他传统CAR共刺激结构域的某些优势。

主权项：1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，包含从N末端到C末端：（i）单链可变片段（scFv），包含VH和VL，其中scFv结合肿瘤抗原，（ii）跨膜结构域，（iii）GITR胞内结构域，作为共刺激结构域，和（iv）激活结构域；并且所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

全文数据：具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体参考序列表、表格或计算机程序序列表通过EFS-Web与说明书同时提交作为ASCII格式的文本文件，文件名为SequenceListing.txt，创建日期为2017年8月30日，大小为38.7千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并且其全部内容通过引用的形式整体并入本文。发明领域本发明涉及具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体CAR，它有效地攻击过表达肿瘤抗原，如EGFR，间皮素或CD19的肿瘤细胞，而不攻击不表达这种肿瘤抗原的癌细胞。发明背景免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞，作为我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原，并区分异常癌症或感染细胞与正常细胞。用CAR遗传修饰T细胞是设计肿瘤特异性T细胞的最常用方法。靶向肿瘤相关抗原TAA的CAR-T细胞可以输入患者称为过继细胞转移或ACT，代表有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，CAR-T技术的优势在于重编程的工程化T细胞可以增殖并持续存在于患者体内“活药物”[3]，[4]。CARCAR嵌合抗原受体通常由单克隆抗体衍生的单链可变片段scFv组成，其通过铰链和跨膜结构域连接至数量可变的细胞内信号传导结构域：i单个细胞激活的CD3-ζ结构域；或iiCD28或CD1374-1BB作为共刺激结构域，与CD3-ζ结构域串联。图1。CD27信号传导结构域也被用于代替CD28或CD137结构域[1,2]。CAR从第一代没有共刺激结构域演变到第二代具有一个共刺激结构域、到第三代CAR具有几个共刺激结构域。生成具有多个共刺激结构域的CAR所谓的第3代CAR已导致细胞溶解活性增加，并且显著改善了表现出抗肿瘤活性增强的CAR-T细胞的持久性。CAR结构如图1所示。CAR-T细胞有效地用于针对血液癌症靶标的临床试验[6]。最近，CAR-T细胞用于针对间皮素、EGFR、Her-2或其他靶标的实体瘤[5,7]。亲和调节的Her-2和EGFR对癌细胞的特异性比正常细胞高，为CAR-T治疗提供了更高的安全性[5]。EGFREGFR是一种表皮生长因子受体，其在许多类型的癌症中过表达[3]。EGFR是Erb家族的四种受体酪氨酸激酶之一，如ErbB2HER-2，ErbB3HER3和ErbB4HER4[3]。EGFR在增殖、生长调节、血管生成、存活和转移中起重要作用。EFGR含有4个细胞外结构域、跨膜结构域和含有酪氨酸激酶结构域和羧基末尾的细胞内结构域图2。许多类型的癌症，如胶质母细胞瘤和其他癌症都缺失5-273的氨基酸，从而导致EGFRvIII形式的表达[4]。两种形式的EGFR野生型和EGFRvIII对于肿瘤存活信号传导都是至关重要的。EGFR参与MAP激酶、PI3K、AKT、STAT信号通路的调节。开发了许多酪氨酸激酶抑制剂，并且最近开发了靶向EGFR信号传导的免疫治疗方法[5]。间皮素间皮素是一种肿瘤表面抗原，其在许多类型的肿瘤中高度过表达[8]，包括卵巢肿瘤[9]。间皮素-CD28-CD3ζCAR-T细胞已被证明可杀死卵巢肿瘤[10]。CD19分化簇19CD19是由CD19基因编码的蛋白质，并且是在B细胞表面上发现的B淋巴细胞抗原。CD19在许多类型的血液癌症中高度表达[2,6,11,12]。CD19-CD28-CD3ζ和CD19-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞已被证明可以杀死血液癌症[13]。许多CD19-CAR-T细胞临床试验在这种类型的治疗中显示出有希望的临床结果[14]。附图的简要说明图1.CAR的结构。在左图，显示了第一代无共刺激结构域的结构。在中间图中，显示了第二代一个共刺激结构域CD28。在右图中，显示了第三代CD28和4-1BB的两个共刺激结构域[7]。图2.EGFR和EGFRvIII蛋白的结构。图3.EGFR-CAR、间皮素-CAR和CD19-CAR构建体的结构。本发明使用GITR作为共刺激结构域。图4.体外扩增EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞。图5A-5D.FAB染色证明EGFRscFv在转导的T细胞中表达。图6A-6E.EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞对EGFR阳性癌细胞具有高度细胞毒性，但不针对EGFR阴性的癌细胞。图6A-6D显示具有不同共刺激结构域的EGFR-CAR在EGFR高表达的不同癌细胞系中的细胞毒活性。图6E显示EGFR-CAR在EGFR-1阴性的MCF-7细胞中没有细胞毒活性。E：T，效应物与靶细胞的比例。图7.间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞杀伤间皮素阳性的卵巢癌和胰腺癌细胞。图8.在BxPC3细胞中，间皮素-GITRCAR-T细胞比间皮素-28-CD3ζ产生的IFN-γ细胞因子至少低2倍。图9.CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞杀伤CD19阳性的Hela-CD19细胞。CAR-T与靶细胞的比例为10：1。CD19-GITR-z表示CD19-GITR-CD3ζ。1和2显示了TM结构域不同的不同CD19构建体。CD19-GITR-z1具有CD8跨膜结构域，CD19-GITR-z2具有CD28TM结构域。两种构建体对Cd19阳性癌细胞具有大致相同的细胞溶解活性。图10.CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞在Raji-荧光素酶+异种移植NSG小鼠模型中降低肿瘤生长。用CAR-T细胞处理3只小鼠，用1×PBS处理3只小鼠，用T细胞处理1只小鼠。具体实施方式定义如本文所用，“过继细胞疗法”ACT是使用癌症患者自身的抗肿瘤活性T淋巴细胞的治疗，这些T淋巴细胞在体外扩增并重新注入患有癌症的患者中。如本文所用，“亲和力”是单个分子与其配体结合的强度。通常通过平衡解离常数KD或Kd测定和报告亲和力，其被用于评估和分级双分子相互作用的顺序强度orderstrength。如本文所用，“嵌合抗原受体CAR”是指融合蛋白，其包含能够结合抗原的细胞外结构域，衍生自某多肽的跨膜结构域该多肽不同于衍生细胞外结构域的多肽，并且至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体CAR”有时被称为“嵌合受体”、“T-体”或“嵌合免疫受体CIR”。“能够结合抗原的细胞外结构域”是指可以结合某种抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知能够起到传递信号以引起胞内生物过程的激活或抑制的结构域作用的任何寡肽或多肽。如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区域，其独立于其他区域折叠成特定结构。GITR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白是一种表面受体分子，已知可诱导T淋巴细胞存活并抑制调节性T细胞的抑制活性[15]。GITR是TNF家族受体的成员。GITR也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18TNFRSF18，活化诱导型TNFR家族受体AITR，并且是由人类中的TNFRSF18基因编码的蛋白质。GITR具有241个氨基酸，其NCBI参考序列号为NP_004186.1。本发明使用GITR的细胞内结构域SEQIDNO：12，其为NCBI参考序列号NP_004186.1的氨基酸残基184-241。如本文所用，“单链可变片段scFv”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链H链和轻链L链片段的Fv区通过间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。描述发明人已经发现GITR胞内结构域可以替代CAR中的其他传统的共刺激结构域，例如CD28和4-1BB，并且在临床中提供优势。发明人已经证明，具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的CAR激活CAR-T细胞以表达EGFR、间皮素或CD19的ScFv，并杀伤EGFR-，间皮素-或CD19-阳性细胞。作为共刺激结构域的GITR胞内结构域提供优于CD28或4-1BB的优势，因为GITR可以提供以下双重功能：i诱导T细胞效应子功能和激活T细胞，和ii抑制阻断免疫应答的抑制性T调节细胞。含GITR胞内结构域的CART细胞可以减少细胞因子的产生，这导致较少的细胞因子释放综合征CRS。本发明提供靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞，所述肿瘤抗原在许多类型的癌症中高度过表达，例如乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌和血液癌症白血病、淋巴瘤，多发性骨髓瘤。本发明人使用i特异性识别表达肿瘤抗原的癌细胞的抗体以制备scFv，和iiGITR胞内结构域作为共刺激结构域，以产生GITR-CAR-T细胞。本发明人已经证明，本发明的几种GITR-CD3ζ-CAR-T细胞对具有高肿瘤抗原表达的几种癌细胞具有高细胞毒活性，并且在肿瘤抗原阴性细胞中没有活性。本发明提供了嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包含：i单链可变片段scFv，其具有抗肿瘤抗原活性，ii跨膜结构域，iii作为共刺激结构域的GITR胞内结构域，和iv激活结构域。在一个实施方式中，人肿瘤抗原选自下组：EGFR、间皮素、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD38、CD138、VEGFR-2、CD4、CD5、CD30、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD47、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD133、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2HER-2、ErbB3HER3、ErbB4HER-4、EphA2,10a、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、LewisA、LewisY、NGFR、MCAM、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、ROR-2、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9，PTCH1、WT-1、Robol、跨膜受体Frizzled、OX40、CD79b和Notch-1-4。优选的肿瘤抗原是人EGFR、人间皮素和人CD19。本发明的CAR包含与感兴趣的肿瘤抗原特异性结合的单链可变片段scFv。抗体的重链H链和轻链L链片段通过接头序列连接。例如，接头可以是5-20个氨基酸。scFv结构从N-末端到C-末端可以是VL-接头-VH或VH-接头-VL。本发明的CAR包含跨膜的跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或可以人工设计。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合或跨膜蛋白获得。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD28、CD3-ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选在合成跨膜结构域的每个末端有苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在优选的实施方式中，跨膜结构域衍生自CD28或CD8，其提供良好的受体稳定性。本发明的CAR包含GITR胞内结构域作为共刺激结构域。胞内结构域激活结构域是CAR的信号传输部分。在抗原识别后，受体聚集并将信号传递给细胞。最常用的胞内结构域组分是CD3ζCD3Z或CD3ζ，其含有3个ITAM。其在抗原结合后将激活信号传递给T细胞CAR融合蛋白可包含位于scFv的N末端，或scFv的C末端或VH和VL之间的FLAG标签。FLAG标签需要在胞外结构域，而不在胞内结构域。除了FLAG标签之外，可以在构建体中使用其他标签。FLAG标签是优选的标签，因为它不会引起免疫原性并且细胞因子分泌水平降低。本发明的CAR可以在scFv的N-末端包含信号肽，使得当CAR在细胞，例如T细胞内表达时，新生蛋白被导向内质网并随后导向细胞表面并表达。信号肽的核心可含有长的疏水性氨基酸延伸段，其倾向于形成单个α-螺旋。信号肽可以始于短的带正电荷的氨基酸段，这有助于在易位期间实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端，通常存在一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位完成期间或之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。例如，信号肽可以衍生自人CD8或GM-CSF，或其具有1或2个氨基酸突变的变体，条件是信号肽仍然起作用以引起CAR的细胞表面的表达。本发明的CAR可包含间隔序列作为铰链，以连接scFv与跨膜结构域，并在空间上分离抗原结合结构域和胞内结构域。柔性间隔物使得结合结构域在不同方向上定向以使其能够与肿瘤抗原结合。间隔序列可以例如包含IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎环、或其组合。优选人CD28或CD8茎环。图3显示EGFR、间皮素或CD19CAR构建体的结构。使用第二代CAR-T构建体。共刺激结构域是CD28对比、4-1BB对比或GITR胞内结构域本发明。CD19-GITR-CD3ζ设计有CD8和CD28跨膜结构域。本发明提供了编码上述CAR的核酸。编码CAR的核酸可以通过常规方法由特定CAR的氨基酸序列制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从各结构域的氨基酸序列的上述NCBI参考序列号RefSeqID或GenBenk的登录号获得，并且使用标准分子生物学和或化学步骤制备本发明的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且通过组合采用聚合酶链式反应PCR从cDNA文库获得的DNA片段来制备本发明的核酸。可以将编码本发明的CAR的核酸插入载体中，并将所述载体导入细胞中。例如，可以使用病毒载体，如逆转录病毒载体包括慢病毒载体，致癌反转录病毒载体和假型载体，腺病毒载体，腺相关病毒AAV载体，猿类病毒载体，痘苗病毒载体或仙台病毒载体，爱泼斯坦－巴尔病毒EBV载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力使得不在感染细胞中自我复制的病毒载体。例如，当使用逆转录病毒载体时，可以通过基于LTR序列和载体所具有的包装信号序列选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒来实施本发明的方法。包装细胞的实例包括PG13ATCCCRL-10686，PA317ATCCCRL-9078，GP+E-86和GP+envAm-12，以及Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒产生的多种逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞可从许多公司广泛商业获得。本发明提供了修饰的T细胞，用来表达如上所述的嵌合抗原受体融合蛋白。本发明的CAR-T细胞通过CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞中，结果，细胞被激活。表达CAR的细胞的活化根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放，细胞增殖率的改善，细胞表面分子的变化等作为指标来确认。经修饰以表达CAR的T细胞可用作疾病的治疗剂。治疗剂包含表达CAR的T细胞作为活性成分，并且还可以包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。在一个实施方式中，用于本发明的EGFRscFv对人EFGR具有低亲和力，即其具有50nM，或80nM，或100nM，或150nM，和优选≥200nM或250nM的解离常数KD。在一个实施方式中，scFv衍生自C10或P3-5参见参考文献5和8或具有至少90％的序列同一性，如C10或P3-5的序列同一性。优选地，scFv具有至少92％，95％，98％或99％的序列同一性，如C10或P3-5的序列同一性。具有对EGFR低亲和力的scFv的CAR-T细胞表现出与高亲和力抗体细胞类似的强抗肿瘤效应，但对表达生理EGFR水平的正常细胞没有作用，因此它们增加了治疗指数。在一个实施方式中，用于本发明的间皮素scFv衍生自Lanitis等[17]报道的抗间皮素抗体。在一个实施方式中，用于本发明的CD19scFv衍生自Kochenderfer等报道的抗CD19抗体[18]。GITR胞内结构域属于TNFR超家族TNFRSF蛋白家族，并且是激活T细胞的共刺激结构域。发明人发现了使用GITR进行CAR-T治疗的以下优点。GITR-GITRL相互作用通过促进效应T细胞群的扩增和活化，并通过抑制抑制免疫活性的T调节细胞来介导有效的抗肿瘤免疫应答。GITR激活效应细胞和对抑制性调节细胞的抑制功能inhibittherepressingfunctionsofTregulatorycells的双重功能使其对CAR-T免疫疗法有效。本发明证明了含有慢病毒EGFR-GITR-CD3ζ的载体和EGFR-GITR-CAR-T细胞；含有慢病毒间皮素-GITR-CD3ζ的载体和间皮素-GITR-CAR-T细胞；含有慢病毒CD19-GITR-CD3ζ的载体和CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的构建。本发明提供了具有SEQIDNO：2、25或27所示氨基酸序列，或具有与其至少95％、或97％或99％序列同一性的序列的CAR融合蛋白。本发明提供了编码CAR融合蛋白的核酸，该核酸具有SEQIDNO：1、24或26所示序列，或具有与其至少95％、或97％或99％序列同一性的序列。本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括将EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞施用于患有癌症的个体的步骤。本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括向患有癌症的个体施用间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞的步骤。本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括将CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞施用于患有癌症的个体的步骤。在一个实施方式中，使用低亲和力EGFR抗体和作为共刺激结构域的GITR胞内结构域来制备EFGR-GITRCAR-T细胞构建体。将EGFRscFv例如，来自低亲和力抗体C10或P3-5[16]克隆到慢病毒载体的XbaI和EcoRI位点。CAR构建体含有CD8信号肽、来自低亲和力EGFR抗体的EGFRscFv：VH-可变重链－连接肽3－VL可变轻链、CD8铰链、CD28跨膜结构域、GITR胞内结构域和CD3ζ激活结构域。本发明人已经产生针对EGFR阳性癌细胞系，例如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，脑癌等的EGFR-scFv-GITR-CD3ζ-CAR-T细胞。本发明人已经提供数据证明EGFR-GITRCAR-T细胞在培养中有效扩增。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T可靶向EGFR阳性和EGFR-vIII阳性癌细胞。本发明人已经产生针对间皮素阳性癌细胞系，如卵巢和胰腺细胞的间皮素-scFv-GITR-CD3zeta-CAR-T细胞。发明人已证明间皮素-GITRCAR-T细胞在培养中的有效扩增。间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞对间皮素阳性CAR-T细胞呈阳性。本发明人已经产生针对CD19阳性癌细胞系例如宫颈癌细胞和血液癌的CD19-ScFv-GITR-CD3ζ-CAR-T细胞。发明人已证明CD19-GITRCAR-T细胞在培养中的有效扩增。CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞对CD19阳性的CAR-T细胞呈阳性。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T，间皮素-GITR-CD3ζCAR-T和CD19-GITR-CD3ζCAR-T可与化疗，如检查点抑制剂、靶向治疗、小分子抑制剂和抗体联合使用。第三代CAR或其他共刺激信号结构域可与EGFR-GITR-CD3ζCAR、间皮素-GITR-CD3ζCAR和CD19-GITR-CD3ζCAR一起使用。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T，间皮素-GITR-CD3ζCAR-T或CD19-GITR-CD3ζCAR-T与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境VEGFR-1-3的CAR-T的组合可用于增强单一疗法的活性。Bi-scFv-GITRCAR可用于增强单一抗体scFv-GITRCAR，scFv-间皮素CAR或scFv-CD19CAR的活性。以下实施例进一步说明了本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，不应解释为限制。实施例将本发明人在慢病毒载体内产生的EGFR、间皮素Meso、CD19CAR构建体克隆到慢病毒载体的XbaI和EcoRI位点。包含CD8信号肽-EGFRscFv或MesoscFv，或CD19scFv-CD8铰链-CD28跨膜胞内结构域-GITR结构域-CD3ζ的pCD510-FMC63-28z慢病毒CAR构建体插入在XbaI和EcoRI克隆位点之间。在293T细胞中产生慢病毒，通过RT-PCR建立滴度。然后如实施例部分所述，使用等剂量的慢病毒转导T细胞。我们使用CAR慢病毒转导T细胞，并使用对照非转导T细胞测试CAR-T细胞对EGFR、间皮素或CD19阳性细胞系的细胞毒活性。实施例1.细胞系在含有10％FBSAmCell，山景城，加利福尼亚州的DMEMGEHealthcare，芝加哥，伊利诺斯州中培养A1847、SKOV-3、卵巢细胞和BxPC3胰腺癌细胞。利用Ficoll-PaqueGEHealthcare作密度沉降分离人外周血单核细胞PBMC。HEK293FT细胞来自AlStemRichmond，加利福尼亚州的馈赠，并在含有10％FBS的DMEM中培养。在我们的实验室中，通过流式细胞术，使用细胞特异性的表面标记验证所有细胞系。实施例2.EGFR、间皮素、CD19CAR构建体将间皮素P4人抗体Lanitis，等人2012，MolTher20,633-643，EGFRC10人抗体Liu等2015CancerRes75,3596-3607或小鼠CD19FMC063Kochenderfer等，2009，JImmunother32,689-702.[13]的ScFv插入到第二代CAR盒中，侧接人CD8的信号肽和来自人CD8α的铰链区之间的NheI和XhoI限制性位点，接着是iCD28，或iiGITR结构域的跨膜结构域和共刺激结构域，和CD3zeta激活结构域，如图3中所示。合成编码CAR的DNA，并将其亚克隆到第三代的慢病毒载体，SynoBiological中国北京的LentiCMV-MCS-EF1a-puro中。所有CAR慢病毒构建体均在两个方向进行测序以确认CAR序列并用于慢病毒生产。实施例3.编码CAR的慢病毒的产生将1000万个生长停滞的HEK293FT细胞ThermoFisher接种到T75烧瓶中并培养过夜，然后使用CalPhos转染试剂盒Takara，山景城，加利福尼亚州转染pPACKH1慢病毒载体包装混合物SystemBiosciences，帕罗奥图，加利福尼亚州和10μg的各慢病毒载体。第二天，用新鲜培养基替换培养基，48小时后收集含有慢病毒的培养基。通过在2100g离心30分钟清除培养基中的细胞碎片。通过在112,000g离心100分钟收集病毒颗粒，悬浮于AIMV培养基中，等分试样并在-80℃下冷冻。根据制造商的方案使用Lenti-XqRT-PCR试剂盒Takara和7900HT热循环仪ThermoFisher，通过定量RT-PCR测定病毒的滴度以pfuml表示。实施例4.CAR-T细胞的产生和扩增将PBMC以1×106个细胞ml悬浮于含有10％FBS和300UmlIL-2ThermoFisher的AIMV-AlbuMAX培养基ThermoFisher中，与相同数量1：1比例的CD3CD28免疫磁珠ThermoFisher混合，并在未处理的24孔板每孔0.5ml中培养。在24和48小时，慢病毒以5的感染复数MOI加入培养物中，同时加入1μl的TransPlus转导增强子AlStem。随着T细胞在接下来的两周内增殖，每2-3天对细胞进行计数，向培养物中加入含有300UmlIL-2的新鲜培养基，使细胞密度保持在1-3×106个细胞ml。实施例5.流式细胞术为了测量CAR表达，将50万个细胞悬浮在100μl的缓冲液含有0.5％BSA的PBS中，并在冰上与1μl的人血清JacksonImmunoresearch，西格罗夫，宾夕法尼亚州一起温育10分钟。然后利用检测EGFRscFv，MesoscFv或CD19scFv的1μl的别藻蓝蛋白APC标记的抗CD3eBioscience，SanDiego，CA、2μl的7-氨基放线菌素D7-AAD，BioLegend，SanDiego，CA和2μl的生物素标记的多克隆的山羊抗人-Fab2抗体LifeTechnologies或生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体LifeTechnologies检测CAR表达。用3ml缓冲液冲洗细胞，然后悬浮在缓冲液中并在FACSCaliburBDBiosciences上获得。首先分析细胞的光散射与7-AAD染色，然后将7-AAD-活门控细胞的CD3染色对Fas2染色或同种型对照染色作图。实施例6.实时细胞毒性测定RTCA将贴壁靶细胞以每孔1×104个细胞接种到96孔E板AceaBiosciences，圣地亚哥，加利福尼亚州中，并使用基于阻抗的实时细胞分析RTCAiCELLigence系统Acea在培养物中监测过夜AceaBiosciences。第二天，除去培养基并用含有10％FBS±1×105效应细胞CAR-T细胞或未转导的T细胞的AIMV-AlbuMAX培养基替换，进行三次独立重复实验。用RTCA系统再监测E板中的细胞2天，并且将阻抗对时间作图。细胞溶解计算为：没有效应细胞的靶细胞的阻抗-具有效应细胞的靶细胞的阻抗×100没有效应细胞的靶细胞的阻抗。实施例7.细胞因子分泌测定将靶细胞与效应细胞CAR-T细胞或未转导的T细胞以1：1的比例每个1×104个细胞在U形底96孔板中用200μl的含有10％FBS的AIMV-AlbuMAX培养基一起培养，进行三次独立重复实验。16小时后，将上层的150μl培养基转移至V底96孔板，并以300g离心5分钟以沉淀任何残留的细胞。将上层的120μl上清液转移至新的96孔板，并使用来自ThermoFisher的试剂盒根据制造商的方案用ELISA分析人IFN-γ和IL-2的水平。实施例8.EGFR-GITR-CD3ζCAR序列。该实施例的CAR构建体：人CD8信号肽，衍生自C10低亲和力EGFR抗体的人EGFRscFv[5,8]VH-连接肽-VL，CD8铰链，CD28跨膜，共刺激结构域GITR，CD3ζ激活结构域见图3。C10EGFR抗体对A431细胞的解离常数KD为265nM。在EcoR1和XhoI位点内具有EGFR-GITR-CD3ζCAR图3的慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。EGFRscFv的侧翼为NheI和XhoI位点，并且可以被其他scFv替代，例如MESOscFv或CD19scFv。SEQIDNO:1:tctagagccgccaccATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagcgaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaaggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTcagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaattacctgccagggcgatagcctgcgcagctattttgcgagctggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgaccctggtgatgtatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgctttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggcgcgggcaccaaactgaccgtgctgctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAtaggaattc下面的SEQIDNO：2是SEQIDNO：1的氨基酸序列。MALPVTALLLPLALLLHAARPASEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLLEKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGFR-GITRCAR构建体的方案如下所示，其分别显示了SEQIDNO：1和2所示的亚结构域核苷酸序列和氨基酸序列。ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGSEQIDNO:3MALPVTALLLPLALLLHAARPSEQIDNO:4GCTAGC氨基酸：AS核苷酸序列：SEQIDNO:5gaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaaggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTcagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaattacctgccagggcgatagcctgcgcagctattttgcgagctggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgaccctggtgatgtatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgctttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggcgcgggcaccaaactgaccgtgctg氨基酸序列：SEQIDNO:6,其是SEQIDNO：2中带下划线的序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLCTCGAG氨基酸：LEAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccSEQIDNO:7氨基酸序列：SEQIDNO:8，其是SEQIDNO：2中较大的字体，粗体序列。TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGSEQIDNO:9氨基酸序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSEQIDNO:10CAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGSEQIDNO:11氨基酸序列：SEQIDNO:12,其是SEQIDNO:2中的粗体序列。AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAGSEQIDNO:13氨基酸序列：SEQIDNO:14，其为SEQIDNO：2中斜体，较大的字体，加下划线的。实施例9.EGFR-GITR-CD3ζ-CAR的序列该构建体包括人CD8信号肽，衍生自P3-5[5,8]的人EGFRscFvVH-连接肽-VL，CD8铰链，CD28跨膜，GITR共刺激结构域，CD3ζ激活结构域图3。对于431个细胞，P3-5的KD＝88nM。连接肽是3×GGGGS，SEQIDNO：15。序列类似于实施例8中描述的序列，不同之处在于，人EGFRscFv衍生自P3-5。VHP3-5带下划线和粗体的氨基酸不同于C10氨基酸序列。使用www.bioinformatics.orgsms2rev_trans.html反向翻译为最可能的密码子的375碱基序列。gaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaaagctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatgggtgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaaaattaccgcggatgaaagcgcgagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaaggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcSEQIDNO:17VLP3-5加下划线的氨基酸不同于C10氨基酸序列。QSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYLASWYQQKPGQAPTLVTYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLSEQIDNO:18将氨基酸序列反向翻译成最可能的密码子的324碱基序列。cagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaattacctgccagggcgatagcctgcgcagctatctggcgagctggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgaccctggtgacctatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgctttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggcgcgggcaccaaactgaccgtgctgSEQIDNO:19实施例10.EGFR-CD28-CD3ζCAR的序列该构建体包括人CD8信号肽，人EGFRscFvVH-连接肽-VL，CD8铰链，CD28跨膜，CD28共刺激结构域，CD3ζ激活结构域见图3。连接肽是3×GGGGS，SEQIDNO：15。序列与实施例8中描述的序列相似，不同之处在于将CD28用作共刺激结构域。核苷酸序列：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCSEQIDNO:20氨基酸序列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSSEQIDNO:21实施例11.EGFR-4-1BB-CD3ζCAR该构建体包括人CD8信号肽，人EGFRscFvVH-连接肽-VL，CD8铰链，CD28跨膜，4-1BB共刺激结构域，CD3ζ激活结构域见图3。连接肽是3×GGGGS，SEQIDNO：15。序列与实施例8中描述的序列相似，不同之处在于将4-1BB用作共刺激结构域。4-1BB共刺激结构域序列：核苷酸序列：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGSEQIDNO:22氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMetRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELSEQIDNO:23实施例12.间皮素-GITR-CD3ζCAR序列代替如实施例8中所示的SEQIDNO：1和2中的EGFRScFV，将间皮素人P4AbScFv插入到SEQIDNO：1的XhoI和NheI中。间皮素-GITRCAR核苷酸序列如下的SEQIDNO：24所示。前两个突出显示的GCTAGC和CTCGAG分别表示间皮素插入的XhoI和NheI位点。第三个突出显示的CAGCTT显示的是GITR起始位置。ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGCTAGCGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCATTATTCCGATTTTTGGCACCGCGAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGAAGGCCCGTATTGCAGCAGCACCAGCTGCTATGGCGCGTTTGATATTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTCAGAGCGTGCTGACCCAGGATCCGGCGGTGAGCGTGGCGCTGGGCCAGACCGTGAAAATTACCTGCCAGGGCGATAGCCTGCGCAGCTATTTTGCGAGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGACCCTGGTGATGTATGCGCGCAACGATCGCCCGGCGGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTGGCGATTAGCGGCCTGCAGAGCGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCGCGGCGTGGGATGATAGCCTGAACGGCTATCTGTTTGGCGCGGGCACCAAACTGACCGTGCTGCTCGAGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA间皮素-GITRCAR的氨基酸序列如SEQIDNO:25所示。MALPVTALLLPLALLLHAARPASEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLLEKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR实施例13.CD19-GITR-CD3ζCAR序列代替实施例8中所示的EGFRScFV，序列如SEQIDNo1和2所示，将CD19ScFv插入到SEQIDNO：1中的XhoI和NheI位点。CD19-GITR-ζCAR核苷酸序列如下SEQIDNO：26所示。前两个突出显示的GCTAGC和CTCGAG示出了CD19ScFv插入的XhoI和NheI位点。第三个突出显示的CAGCTT示出了GITR起始位置。ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagcgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcactcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAACD19-GITRζCAR的氨基酸序列如SEQIDNO:27所示。用粗体表示CD19scFv，用下划线表示GITR。我们还使用CD19-FlagScFv和GM-CSF信号肽代替CD8信号肽来产生CD19-Flag-GITR-CD3ζCAR，该CAR的活性与上述CD19-GITR-CD3ζ构建体相似。我们还测试了含CD8跨膜结构域IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC，SEQIDNO:28，而非CD28跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζ，并且两种构建体见图3具有相似的活性。具有CD8跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζ的核苷酸和氨基酸序列如下所示。ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGCGGTTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAASEQIDNO:29具有CD8跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζCAR的氨基酸序列如下所示，标有下划线的为CD8跨膜结构域，GITR结构域以粗体显示。实施例14.EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞显示培养中有效扩增EGFR-GITRCAR-T细胞在体外有效扩增图4。EGFR-GITRCAR-T细胞在培养20天期间扩增超过60倍。EGFR-4-1BB-CD3z-CAR-T细胞在16天后生长减缓。CD19-CD28-CD3ζCAR-T和非CD19-CAR-T细胞和未转导的T细胞也在体外有效扩增。如图4所示，结果显示了EGFR-GITR-CD3ζCAR细胞比EGFR4-1BB-CD3ζ和EGFR28-CD3ζCAR-T细胞更好地扩增。实施例15.用EGFR-CAR慢病毒构建体转导T细胞表明EGFRScFv的表达为了检测转导，从C10EGFR抗体表达人scFv，CAR-T细胞用抗人FAB抗体染色。在图5A-5D中，Fab染色证明EGFRscFv在转导的T细胞中的表达。EGFR-CAR-T细胞中用抗人Fab抗体的Fab染色高于未转导的T细胞中的Fab染色。如图5所示，结果显示了用慢病毒CAR的有效转导。EGFRscFv的表达比对照非转导细胞9.3％高22-32％。实施例16.EGFR-GITR-CD3ζCAR显示针对EGFR阳性癌细胞的高细胞毒活性，并且对EGFR阴性癌细胞无细胞毒活性。实时细胞毒性测定证明EGFR-GITR-CD3ζ-CAR细胞对EGFR阳性癌细胞具有高细胞毒活性图6。EGFR-CAR的细胞毒活性是癌症类型依赖性的。例如，在U87胶质母细胞瘤细胞中，EGFR-GITR-CD3z-CAR-T细胞具有比EGFR-CD28-CD3ζ-CAR-T细胞更好的细胞毒活性图6A。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T活性是剂量依赖性的；与10：1的比例相比，在20:1下活性增加了。在SKOV-3卵巢癌细胞中，EGFR-GITR-CD3ζCAR-T和EGFR-CD28-CD3ζCAR-T细胞的活性相同，但高于EGFR-4-1BB-CD3ζ和模拟－对照的CAR-T细胞的活性图6B。GITR和CD28共刺激结构域在SKOV-3卵巢癌细胞中具有比含有4-1BB的CAR-T细胞更高的细胞毒活性图6B。在另一种卵巢癌细胞系A1847中，EGFR-GITR-CD3ζ活性在30：1E：T效应物：靶细胞比例下优于EGFR-CD28-CD3ζ图6C。在胰腺癌细胞BxPC3中，EGFR-CD28-CD3ζ的细胞毒活性高于EGFR-GITR-CD3ζ和EGFR-41BB-CD3ζ图6D。在EGFR阴性细胞MCF-7细胞中没有细胞毒活性图6E。实施例17.间皮素-GITR-CD3ζCAR对间皮素阳性癌细胞显示高细胞毒活性。我们用间皮素-GITR-CD3ζCAR构建体产生间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞图3，并测试它们对A1847、SKOV-3卵巢癌和BxPC3胰腺癌细胞的细胞溶解活性。具有CMV启动子的慢病毒载体用于产生间皮素-GITR-CD3ζ和间皮素-CD28-CD3ζ第2代CAR-T细胞。具有EF1启动子的慢病毒载体用于产生间皮素-28-41BB-CD3第3代CAR-T细胞。将间皮素-28-CD3ζCART细胞标记为Meso-28-CAR-T第二代细胞。将间皮素-GITR-CD3ζCART细胞标记为Meso-GITRCAR-T细胞。将间皮素-28-4-1BB-CD3ζCART细胞标记为Meso-28-CAR-T第三代细胞。间皮素-GITR-CD3ζCAR和间皮素-CD28-CD3ζCAR杀伤间皮素阳性癌细胞图7，并且具有比间皮素-28-4-1BB-CD3ζ第三代CAR-T细胞更好的活性。如图7所示，下图显示了在SKOV-3细胞中，间皮素-GITR-CAR-T细胞比间皮素-CD28-CD3ζCART细胞和间皮素-28-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞的杀伤更快。实施例18.间皮素-GITRCAR-T细胞对癌细胞具有相同的细胞毒活性，并且比间皮素-CD28CAR-T细胞产生更少的IFN-γ细胞因子。我们测试了间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞和间皮素-CD28-CD3ζ；两者对BxPC3癌细胞具有相同的细胞毒活性，因为它们产生细胞因子IFN-γ。间皮素-GITR-CD3ζCART细胞分泌的IFN-γ比间皮素-CD28-CD3ζCART细胞分泌的IFN-γ少2倍图8，这表明间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞可能由于患者细胞因子释放综合征较少，在临床上具有优势。实施例19.CD19-GITR-CD3ζCAR对CD19阳性癌细胞显示高细胞毒活性。我们用CD8跨膜结构域和CD28跨膜结构域CAR-T细胞产生CD19-GITR-CD3ζ，并比较它们对Hela-CD19+阳性细胞的细胞溶解活性。两种CD19-GITRCAR-T细胞均具有50％的杀伤活性图9。CD19-CD28-CD3ζ具有100％的杀伤活性未示出。CD19-GITRCAR-T细胞较低的活性可导致临床上对正常细胞的毒性较小，并且在未来的临床试验中具有优势。实施例20.EGFR-GITR-CD3ζCAR阻断小鼠中Raji白血病细胞的肿瘤生长。我们比较了Raji异种移植小鼠模型中CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的体内杀伤活性。将Raji-荧光素酶+细胞皮下注射到NSG小鼠中。在第12天，当肿瘤达到50mm3时，静脉内注射CD19-GITR-CAR-T细胞1×107个细胞小鼠。与1×PBS对照处理小鼠或注射T细胞对照的小鼠相比，CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞降低生物发光强度BLI图10。结果证明了CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的高体内功效。与信号增加或未改变的对照组相比，用Cd19-GITR-Cd3CAR-T细胞处理的所有三只小鼠都降低了BLI图10。参考文献1.Maus,M.V.,Haas,A.R.,Beatty,G.L.,Albelda,S.M.,Levine,B.L.,Liu,X.,Zhao,Y.,Kalos,M.,和June,C.H.2013.表达嵌合抗原受体的T细胞可引起人类的过敏反应.CancerImmunolRes1,26-31.2.Maus,M.V.,Grupp,S.A.,Porter,D.L.,和June,C.H.2014.抗体修饰的T细胞：CAR在血液系统恶性肿瘤方面处于领先地位.血液123,2625-2635.3.Lemmon,M.A.,Schlessinger,J.,和Ferguson,K.M.2014.EGFR家族：不是原型受体酪氨酸激酶.ColdSpringHarbPerspectBiol6,a020768.4.Choi,B.D.,Archer,G.E.,Mitchell,D.A.,Heimberger,A.B.,McLendon,R.E.,Bigner,D.D.,和Sampson,J.H.2009.EGFRvIII靶向接种治疗恶性胶质瘤.BrainPathol19,713-723.5.Liu,X.,Jiang,S.,Fang,C.,Yang,S.,Olalere,D.,Pequignot,E.C.,Cogdill,A.P.,Li,N.,Ramones,M.,Granda,B.等人.2015.亲和调节的ErbB2或EGFR嵌合抗原受体T细胞在小鼠中表现出增强的抗肿瘤的治疗指数.CancerRes75,3596-3607.6.Maus,M.V.,和June,C.H.2014.在研的治疗骨髓瘤的CART.ClinCancerRes20,3899-3901.7.Morello,A.,Sadelain,M.,和Adusumilli,P.S.2016.靶向间皮素的CAR：将T细胞驱动至实体肿瘤.CancerDiscov6,133-146.8.Lamers,C.H.,Willemsen,R.,vanElzakker,P.,vanSteenbergen-Langeveld,S.,Broertjes,M.,Oosterwijk-Wakka,J.,Oosterwijk,E.,Sleijfer,S.,Debets,R.,和Gratama,J.W.2011.用离体工程化T细胞处理的患者对转基因和逆转录病毒载体的免疫应答.血液117,72-82.9.Beatty,G.L.,Haas,A.R.,Maus,M.V.,Torigian,D.A.,Soulen,M.C.,Plesa,G.,Chew,A.,Zhao,Y.,Levine,B.L.,Albelda,S.M.等人.2014.间皮素特异性嵌合抗原受体mRNA工程化的T细胞在实体恶性肿瘤中诱导抗肿瘤活性.CancerImmunolRes2,112-120.10.Lanitis,E.,Poussin,M.,Hagemann,I.S.,Coukos,G.,Sandaltzopoulos,R.,Scholler,N.,和Powell,D.J.,Jr.2012.用全人抗间皮素嵌合受体转导的原代人淋巴细胞的重定向抗肿瘤活性.MolTher20,633-643.11.Maus,M.V.,和June,C.H.2013.焦点焦点：用于治疗多发性骨髓瘤的竞争性的CAR.ClinCancerRes19,1917-1919.12.Kochenderfer,J.N.,和Rosenberg,S.A.2013.用表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞治疗B细胞癌.NatRevClinOncol10,267-276.13.Kochenderfer,J.N.,Feldman,S.A.,Zhao,Y.,Xu,H.,Black,M.A.,Morgan,R.A.,Wilson,W.H.,和Rosenberg,S.A.2009.抗CD19嵌合抗原受体的构建和临床前评估.JImmunother32,689-702.14.Ramos,C.A.,Savoldo,B.,和Dotti,G.2014.CD19-CAR试验.癌症J20,112-118.15.Knee,D.A.,Hewes,B.,和Brogdon,J.L.2016.抗GITR癌症免疫疗法的基本原理.EurJCancer67,1-10.16.Zhou,Y.,Drummond,D.C.,Zou,H.,Hayes,M.E.,Adams,G.P.,Kirpotin,D.B.,和Marks,J.D.2007.单链Fv抗体片段亲和力对表达表皮生长因子受体的肿瘤细胞的纳米颗粒靶向的影响.JMolBiol371,934-947.17.Lanitis,E.等人.2012用全人抗间皮素嵌合受体转导的原代人淋巴细胞的重定向抗肿瘤活性.MolTher20,3,633-643.18.KochenderferJN,等人.2009抗CD19嵌合抗原受体的构建和临床前评估.JImmunother827689-702序列表普曼生物技术有限公司湖南远泰生物技术有限公司通用医疗公司具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体119995-8006.WO01US62381,4182016-08-3030PatentInversion3.511590DNA智人Homosapiens1tctagagccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctg60ctccacgccgccaggccggctagcgaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaa120aaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctat180gcgattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggcggcattatt240ccgatttttggcaccgcgaactatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgcg300gatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcg360gtgtattattgcgcgcgcgaagaaggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcg420tttgatatttggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggcggtggttctggt480ggcggtggttctggtggcggtggttctcagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagc540gtggcgctgggccagaccgtgaaaattacctgccagggcgatagcctgcgcagctatttt600gcgagctggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgaccctggtgatgtatgcgcgcaac660gatcgcccggcgggcgtgccggatcgctttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagc720ctggcgattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcggcgtgggat780gatagcctgaacggctatctgtttggcgcgggcaccaaactgaccgtgctgctcgagaag840cccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagccc900ctgtccctgcgcccagaggcgagccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgaggggg960ctggacttcgccagtgataagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggct1020tgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgcagcttggactgcac1080atctggcagctgaggagtcagtgcatgtggccccgagagacccagctgctgctggaggtg1140ccgccgtcgaccgaagacgccagaagctgccagttccccgaggaagagcggggcgagcga1200tcggcagaggagaaggggcggctgggagacctgtgggtgagagtgaagttcagcaggagc1260gcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctagga1320cgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatgggggga1380aagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataag1440atggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcac1500gatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatg1560caggccctgccccctcgctaataggaattc15902521PRT智人Homosapiens2MetAlaLeuProValThrAlaLeuLeuLeuProLeuAlaLeuLeuLeu151015HisAlaAlaArgProAlaSerGluValGlnLeuValGlnSerGlyAla202530GluValLysLysProGlySerSerValLysValSerCysLysAlaSer354045GlyGlyThrPheSerSerTyrAlaIleSerTrpValArgGlnAlaPro505560GlyGlnGlyLeuGluTrpMetGlyGlyIleIleProIlePheGlyThr65707580AlaAsnTyrAlaGlnLysPheGlnGlyArgValThrIleThrAlaAsp859095GluSerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGlu1001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权利要求：1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，包含从N末端到C末端：i单链可变片段scFv，包含VH和VL，其中scFv结合肿瘤抗原，ii跨膜结构域，iiiGITR胞内结构域，作为共刺激结构域，和iv激活结构域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人EGFR。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人EGFR是野生型或EGFRvIII。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人间皮素。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人CD19。6.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述激活结构域是CD3ζ。7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述GITR胞内结构域包含SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。8.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构域是人CD28或人CD8。9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQIDNO：2、25或27所示的氨基酸序列，或与其至少95％的序列同一性。10.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的融合蛋白。11.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQIDNO.1、24或26所示的序列，或与其至少95％的序列同一性。

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