申请/专利权人：山西农业大学

申请日：2020-09-03

公开（公告）日：2023-10-20

公开（公告）号：CN112034188B

主分类号：G01N33/74

分类号：G01N33/74;G01N33/543;G01N21/31

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.20#授权;2020.12.22#实质审查的生效;2020.12.04#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，包括如下步骤：S1、合成牛CART基因，亚克隆构建到表达载体pATX1上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的CART活性肽；S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；S3、通过BLItz单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。本发明无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题，为鉴定CART受体及CART调控牛卵泡发育机理奠定基础，并为筛选神经肽受体提供思路。

主权项：1.一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、合成牛CART基因，亚克隆构建到表达载体pATX1上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的CART活性肽；S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；S3、通过BLItz单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体；所述步骤S1具体包括如下步骤：S11、取PCR管并标记，依次加入4μL同源重组酶，5μL目的基因片段，1μL线性化载体；吹打均匀后，置于预热的50℃PCR仪中孵育45min，得重组质粒；S12、检测所得重组质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6μLPvuI内切酶，10μL10×FastDigestBufferFastDigestGreenBuffer，50μL质粒；将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30min后弃上清，加入1mL70％乙醇4℃离心5min，进行回收；S13、将质粒瞬时转染到XtenCHO细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50％以下，具体操作如下：1转染前一天，接种27×106个细胞到完全培养基中培养；2稀释15μgDNA至1.5mL完全培养基中，轻柔混匀，另稀释45μLPEI转染试剂至1.5mL完全培养基中，轻柔混匀，各自室温孵育5min；3将稀释后的PEI加入稀释后的DNA中，此时转染混合物总体积为3mL，轻柔混匀，室温孵育25min；4将3mL转染混合物加入27mL细胞悬液中，轻柔混匀，37℃，5％CO2，130rpm条件下培养10d，至细胞活率降到50％以下收样；S14、CART蛋白160mL放大及纯化1对pATX1表达结构进行无内毒素DNA制备，采用PureLinkTMExpiEndotoxin-FreeMaxiPlasmidPurificationKit去内毒素质粒提取试剂盒；2亲和蛋白A树脂的纯化；3清洗树脂：根据树脂用量选择10倍pH7.5的树脂体积bindingbuffer清洗；4上样：将收集的上清样品过柱，此过程缓慢进行，加速时必须控制速度：1s滴；5淋洗：用PBSpH7.5淋洗结合液，结合液通过自身重力向下滴，控制速度在1s滴；6用20mM柠檬酸pH2.7缓冲液进行洗脱，缓慢进行；7中和缓冲液：1MTris-HClpH9.0，每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶，上柱前样品和上柱后流穿液的上样量为10μL，其他上样量为20μL；8将泳道E1-E6组分混合，进行缓冲液交换和浓缩，蛋白终浓度为：1.7mgmL，总蛋白量：500μg；S15、生物素标记CART将生物素使用DMF溶解，浓度20mgmL，并将抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH8.5，终浓度1-10mgmL；按每mg抗体加5μL生物素溶液，室温避光搅拌2h，收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS3-4次，经生物素标记后终浓度：0.1mgmL，总蛋白：495μg；所述步骤S3具体包括如下步骤：在BLItzPro1.3系统中操作，反应体积300μL，实验方法如下:1基线平衡：将SA传感器放入PBS中浸湿10min，在系统中进行第一次基线平衡，时间60s；2CART固定：将传感器伸入含有生物素标记的终浓度为0.1μgμL的CART溶液中，时间300s；3基线平衡：将传感器伸入PBS中进行第二次基线平衡，时间240s；4结合测定：将传感器移至包含膜碎片的PBS溶液中进行结合测定，时间300s；5蛋白解离：将结合后的探针再次转移到PBS中进行解离实验，时间300s。

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