申请/专利权人：霸州市砚创科技有限公司

申请日：2019-12-20

公开（公告）日：2023-10-27

公开（公告）号：CN111089973B

主分类号：C07K14/145

分类号：C07K14/145;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/535;C12N15/66;C12N15/70;C07K1/14

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.27#授权;2020.05.29#实质审查的生效;2020.05.01#公开

摘要：本发明提供一种牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法，属于分子生物学技术领域，包括固相，固相上固定了VSV抗原，VSV抗原包括重组P1‑87蛋白，P1‑87蛋白包含SEQIDNO.1氨基酸序列，终止液，含有检测用抗体的液相，检测用抗体包括用于检测IgG的HRP‑抗牛IgG抗体。本发明提供的试剂盒以牛水泡性口炎病毒截短的P蛋白建立间接ELISA诊断方法，能够使重组蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，提高抗原效价，提高抗原特异性，进而提高检出率。

主权项：1.一种重组P1-87蛋白的制备方法，所述P1-87蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，包括以下步骤：S1、P1-87蛋白的原核表达系统的构建；S2、重组蛋白的诱导表达，诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在；S3、重组蛋白的分离纯化；其中，所述步骤S1具体包括：a、提取水泡性口炎病毒RNA，进行反转录，以反转录产物为模板进行PCR扩增，纯化回收得目的片段；b、利用EcoRⅠ与XhoⅠ分别对目的片段、pET-30c+载体进行双酶切，然后将酶切后的目的片段和pET-30c+载体进行连接，转入E.coliBL21菌中，提取阳性质粒，得pETVSV-P1-87；c、将pETVSV-P1-87转入E.coliBL21菌中，筛选阳性克隆，得P1-87蛋白的原核表达系统；所述步骤S3具体包括：a、菌体裂解：将诱导好的菌液离心收集菌体，用pH8.0的TE洗涤两次，重悬于pH8.0的TE中，超声破碎处理，离心收集沉淀，溶解于含6M盐酸胍的Tris-HCl缓冲液中，冰上静置0.8-1.2h，间歇混匀溶解，离心收集上清；b、重组蛋白纯化：将步骤a中收集的上清加入镍离子柱，再加入结合缓冲液将其轻轻混匀，混悬30-40min，用洗脱缓冲液洗下目的蛋白，离心收集上清；所述结合缓冲液为0.1MNaH4PO4，0.2M熊果苷，质量分数3％的硫酸葡聚糖钠盐，0.01MTris-ClpH8.0；所述洗脱缓冲液为0.1MNaH4PO4，0.01MTris-ClpH4.5；c、重组蛋白的复性：用100mMEDTA煮透析袋8-10min，将将步骤b中收集的上清装入透析袋，4℃下在PBS液中透析2-3d，期间换液2-3次。

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