申请/专利权人：唐颐生物医学(天津)有限公司;天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院

申请日：2023-08-07

公开（公告）日：2023-11-10

公开（公告）号：CN117025540A

主分类号：C12N5/10

分类号：C12N5/10;C12N15/867;C12N15/54;C12N15/55;C12Q1/02;C12R1/91

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2023.11.10#公开

摘要：本发明提供了一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用，从新生1‑7天的动物曲精小管组织中分离支持细胞，导入含有hTERT基因的慢病毒载体，通过抗性药物筛选具有支持细胞标志物的单克隆细胞株，再导入含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CD慢病毒载体即可获得携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系。该细胞株能在体外不断增殖，还具备正常支持细胞应有的细胞表型及功能。通过自杀基因的药物筛选，可以安全的控制该细胞在体内的生长与死亡，生物体内应用安全性高，为多种炎性疾病的治疗提供一种安全、可靠的支持细胞材料。

主权项：1.一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：消化步骤将动物曲精小管取出后用生理盐水冲洗，用眼科剪将其剪碎并与复合消化酶溶液混合，在35℃条件下消化15分钟，得曲精小管消化混合物；所述动物包括但不限于大鼠、小鼠、猴、牛、羊、猪、狗或兔；细胞悬液制备步骤用50-70μm的过滤网对曲精小管消化混合物进行过滤得过滤液，即为细胞悬液；第一次离心步骤将细胞悬液进行第一次离心，离心速度为300rpmmin，离心时间为5分钟，弃掉管底沉渣，获得第一次离心上清液；第二次离心步骤将第一次离心上清液进行第二次离心，离心速度为1200rpmmin-2000rpmmin，离心时间为5分钟，收集管底离心细胞；转染前细胞培养步骤将离心获得的细胞接种于完全培养基中，待贴壁12小时后全量换液，将悬浮及半贴壁的精原干细胞清除；待细胞汇合达到70％-80％时，以消化酶消化1-3分钟，以1:3传代；待细胞生长至第3代时用于转染；第一次转染步骤以支持细胞为宿主细胞，用pGMLV-hTERT-PURO慢病毒载体对支持细胞进行转染，转染方式为电转；第一次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3-10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到永生化支持细胞系；第二次转染步骤再以永生化支持细胞系为宿主细胞，用pGMLV-CD-PURO慢病毒载体对其进行转染，转染方式为电转；第二次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3-10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系。

全文数据：

权利要求：

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