申请/专利权人：新疆农业大学

申请日：2022-08-17

公开（公告）日：2023-11-17

公开（公告）号：CN117069834A

主分类号：C07K16/18

分类号：C07K16/18;C12N15/70;C12N15/12

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.12.05#实质审查的生效;2023.11.17#公开

摘要：本发明公开了细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，涉及生物工程技术领域，包括：构建EgM123基因原核表达载体：pET28a‑EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，IPTG诱导pET28a‑EgM123基因表达，SDS‑PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Westernblot和ELISA检测其反应原性，为制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白。本发明制备的EgM123蛋白单克隆抗体可直接用于检测感染动物脏器组织抗原定位，节省检测诊断时间，实现高效定性诊断；同时，也可用于犬粪便虫体抗原的检测，实现对细粒棘球绦虫感染犬更为高效、便捷的诊断，利于对包虫病的净化，实现从感染源头到易感群体形成综合性的防控体系。

主权项：1.细粒棘球绦虫EgM123蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：构建EgM123基因原核表达载体：pET28a-EgM123，通过双酶切与基因测序验证，构建成功质粒转化BL21感受态细胞，IPTG诱导pET28a-EgM123基因表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白大小及表达，并优化出最佳表达条件，将复性浓缩后的蛋白使用Westernblot和ELISA检测其反应原性，为制备EgM123蛋白单克隆抗体提供免疫蛋白，具体包括以下步骤：S1、构建EgM123基因原核表达载体：1利用EcorI和XhoI限制性内切酶将pcDNA3.1His-EgM123基因重组质粒和pET28a载体双酶切，设置反应体系与反应条件，按照胶回收说明书回收酶切产物；2连接产物转化DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基，在37℃培养箱过夜培养；3次日观察菌落生长，在LB液体培养基中加入单菌落过夜培养，待菌液出现浑浊，进行菌液PCR，1％琼脂糖电泳跑胶验证；4将菌液PCR结果阳性的菌液按照天根小提质粒试剂盒的提取方法进行质粒提取；使用单滴分光计检测质粒浓度，将260280值在1.8～2.0之间的质粒使用EcorI和XhoI内切酶双酶切，酶切体系为25μL；酶切产物使用1％琼脂糖电泳验证；5将酶切条带正确的质粒测序；S2、EgM123蛋白的原核表达：1将S1中连接成功的质粒与pET28a载体分别转化BL21，检测蛋白EgM123基因表达，方法同步骤S1中转化DH5α相同；2在LB液体培养基中加入单菌落培养12h，次日菌液PCR检测。3将阳性菌液按照1:100加入到液体培养基培养，至OD600nm值为0.6时，加入IPTG使终浓度达0.4mM培养3h；4将菌液离心弃去上清，PBS重悬菌液再次离心弃去上清；5使用PBS将菌液重悬，冰上超声15min，超声3s停5s，将超声后菌液低温离心，分装上清与沉淀，使用SDS-PAGE电泳检测；S3、EgM123蛋白原核表达诱导条件的优化：分别针对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间优化EgM123蛋白原核表达诱导条件；S4、EgM123蛋白的纯化、复性及浓缩：根据按照步骤S3中优化的诱导条件，诱导1L菌液，收集菌液沉淀，使用PBS洗涤三次，将沉淀分装到4个50mL离心管内，使用包涵体BindingBuffer超声菌体，使目的蛋白溶解于上清中，将超声后菌液于5000rmin低温离心10min，回收上清低温保存，进行下一步纯化；S5、EgM123蛋白的反应原性检测：A、Westernblot检测EgM123蛋白的表达；B、ELISA检测EgM123的反应原性。

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权利要求：

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