申请/专利权人：南方医科大学南方医院

申请日：2019-11-07

公开（公告）日：2023-11-21

公开（公告）号：CN111139286B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806;C12Q1/6886;C12N15/10;C40B50/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.11.21#授权;2020.06.05#实质审查的生效;2020.05.12#公开

摘要：本发明涉及一种BCR高通量测序文库的构建方法，其特征在于：其方法基于对BCR的重链IgG及两条轻链IgL及IgK，各自设计了一套引物集合，能扩增目前已发现的所有IgG，IgL，IgK的不同等位基因，同时在扩增时各自加入一套内参序列，经过后期使用内参的校正，能真实的还原BCR的真实情况而建立的高通量测序文库的构建方法。可实现三套引物集合能完全扩增出目前已知的所有IgG，IgL，IgK包含的等位基因，解决了目前混合引物在扩增时会遗漏部分等位基因缺陷；在PCR扩增时加入了内参序列，后期数据分析根据内参进行校正，能有效的纠正PCR过程中产生的偏好性问题；本发明可满足RNA总量大于100ng的样品建库要求。

主权项：1.一种BCR高通量测序文库的构建方法，其特征在于：其方法基于对BCR的重链IgH及两条轻链IgL及IgK，各自设计了一套引物集合，能扩增目前已发现的所有IgH，IgL，IgK的不同等位基因，同时在扩增时各自加入一套内参序列，经过后期使用内参的校正，能真实的还原BCR的真实情况而建立的高通量测序文库的构建方法;所述方法包括以下步骤：S1、cDNA模板制备：包括细胞RNA提取、组织RNA提取，组织起始量为大于1mg，对mRNA进行质量鉴定及浓度检测，RNA总量大于100ng，进行混合合成，且按一定要求配置混合体系，并在PCR仪上进行反应，形成产物cDNA模板；所述的S1的cDNA模板制备包括以下：（1）细胞RNA提取：细胞来源为人的外周血分离得到的淋巴细胞，细胞个数为大于500个，加入细胞裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；（2）组织RNA提取：组织来源为人手术下来的肿瘤组织与正常组织，起始量为大于1mg，采用液氮研磨后加入裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；（3）对mRNA进行质量鉴定及浓度检测，要求mRNA的结果完整，RNA总量大于100ng；（4）为了提高cDNA的产量，我们在合成cDNA时做了前期优化处理，按照下表配置混合体系，并在PCR仪上进行反应，反应程序为：70℃，1min，反应程序结束后立马把产物放于冰上3min；试剂名称体积mRNA100ng-1ugX最大体积为10ul1uguloligodT1ulRNAse-freewaterUpto12ul（5）配置下表的混合体系，与步骤（4）的产物混合后放在PCR仪上进行反应，反应程序为：42℃，90min；75℃，15min；4℃，∞；反应后的产物即为合成好的cDNA模板，将用于下一步；试剂名称体积5XBuffer4ul0.1MDTT1ul10mMdNTP1ul40UulRNAseInhibitor1ul200UulSuperScriptII1ulS2、纯化好的cDNA模板中加入0.1ul的内参序列，进行PCR反应，形成产物B；所述的S2具体包括以下：（1）将cDNA模板中加入0.1ul的内参序列，内参序列是根据IgH，IgK及IgL的V基因的表达量多少按相应的比例混匀后加入，根据扩增的需要每次只加入对应的内参序列，如需要扩增IgH，则加入IgH对应的内参，混匀后成cDNA模板A，作为模板进行PCR反应，按照下表配制反应体系；试剂名称体积2XHiFiHotStart25ulcDNA模板A2.5ulPrimier15ulPrimier25ulNuclease-freewater12.5ul（2）再次PCR反应程序如下表：循环数变性退火延伸195℃3min----22-3298℃20s----22-3255℃--60℃30s--22-32----72℃1min172℃5min（3）反应完成后，对该产物进行纯化，最后用30ulNuclease-freewater进行洗脱，得到产物B；S3形成产物B连接高通量测序接头得到最终的测序文库;所述的步骤S2加入的引物和内参序列共349条;所述引物和内参序列要求如下：当受体为人BCRIgH重链时：步骤S2中的cDNA模板A中的内参序列由SEQIDNO:1-SEQIDNO:100组成；当受体为人BCRIgK轻链时：步骤S2中的cDNA模板A中的内参序列由SEQIDNO:101-SEQIDNO:200组成；当受体为人BCRIgL轻链时：步骤S2中的cDNA模板A中的内参序列由SEQIDNO:201-SEQIDNO:300组成；当受体为人BCRIgH重链时：步骤S2中的Primer1的核苷酸序列由SEQIDNO:301-SEQIDNO:327组成；当受体为人BCRIgK轻链时：步骤S2中的Primer1的核苷酸序列由SEQIDNO:328-SEQIDNO:336组成；当受体为人BCRIgL轻链时：步骤S2中的Primer1的核苷酸序列由SEQIDNO:337-SEQIDNO:346组成；当受体为人BCRIgH重链时：步骤S2中的Primer2的核苷酸序列由SEQIDNO:347组成；当受体为人BCRIgK轻链时：步骤S2中的Primer2的核苷酸序列由SEQIDNO:348组成；当受体为人BCRIgL轻链时：步骤S2中的Primer2的核苷酸序列由SEQIDNO:349组成。

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百度查询： 南方医科大学南方医院 一种BCR高通量测序文库的构建方法

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