申请/专利权人：广州铭康生物工程有限公司

申请日：2022-02-24

公开（公告）日：2023-11-24

公开（公告）号：CN114441702B

主分类号：G01N30/89

分类号：G01N30/89;G01N30/06;G01N30/74

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.11.24#授权;2022.05.24#实质审查的生效;2022.05.06#公开

摘要：本发明提供了一种检测I、II型rhTNK‑tPA含量的方法，涉及分析化学技术领域。该方法包括1将I、II型rhTNK‑tPA标准品按不同百分比含量配制混合溶液，进行样品前处理，然后采用反相高效液相色谱法进行分析检测，建立标准曲线；2将待测rhTNK‑tPA样品溶液进行与步骤1相同的前处理，采用与步骤1相同的色谱法进行分析检测，得出I、II型rhTNK‑tPA的含量。通过本发明的方法，可使rhTNK‑tPA的III型峰的基线完全分离，分离度可达到2.8以上；本发明的方法准确度可达到86.52％～116.90％，重复性和精密度的相对标准偏差RSD＜2％。

主权项：1.一种检测I、II型rhTNK-tPA含量的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将I、II型rhTNK-tPA标准品按不同百分比含量配制混合溶液，进行样品前处理，然后采用反相高效液相色谱法进行分析检测，建立标准曲线；（2）将待测rhTNK-tPA样品溶液进行与步骤（1）相同的前处理，采用与步骤（1）相同的色谱法进行分析检测，得出I型、II型rhTNK-tPA的含量；其中，所述反相高效液相色谱法采用SinoChromC8或Zorbax300SB-C8反相色谱柱；以0.1%~0.3%三氟乙酸和水溶液为流动相A，以0.1%~0.3%三氟乙酸和乙腈溶液为流动相B进行线性洗脱；所述样品前处理包括:（a）稀释和酶解：使用样品稀释液将样品稀释至浓度为1.0~1.5mgmL；添加1%~10%ww的纤维蛋白溶酶在35~38℃酶解30~90min；所述稀释液包括54~56gL精氨酸和0.03%~0.05%的吐温80；（b）变性和还原：将经酶解的样品用变性缓冲液进行1:1vv稀释至浓度为0.45~0.75mgmL，然后加入二硫苏糖醇还原；所述变性缓冲液包括475~485gL尿素，60.55~60.65gLTris和1.15~1.25gLNa2EDTA；所述线性洗脱条件为：0~70min，65%~75%的流动相A和25%~35%的流动相B；70~120min，50%的流动相A和50%的流动相B；然后用100%的流动相B再生色谱柱；所述标准曲线为以I型rhTNK-tPA含量与II型rhTNK-tPA含量之比作为横坐标，I型rhTNK-tPA标准品峰面积与II型rhTNK-tPA标准品峰面积之比作为纵坐标作图，建立线性回归方程。

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权利要求：

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