申请/专利权人：华南师范大学

申请日：2018-12-21

公开（公告）日：2023-12-05

公开（公告）号：CN109868258B

主分类号：C12N5/0793

分类号：C12N5/0793

优先权：["20171227 CN 2017114468519"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.05#授权;2019.07.05#实质审查的生效;2019.06.11#公开

摘要：本发明公开了诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物及方法。发明人研究发现作用GSK‑3β、TGF‑β和BMP信号通路，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路，可以将将星形胶质细胞诱导成功能性神经元。通过将活化的胶质细胞以及胶质疤痕转化成功能性神经元来防治脑退化和脑损伤，将可能带动传统抗衰老保健品产业及重大脑疾病治疗上的革新。

主权项：1.组合物在制备将星形胶质细胞诱导成功能性神经元诱导剂中的应用，其中，组合物可同时作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路；所述组合物由SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27632、DAPT、VPA和FGF2组成；所述组合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27632浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgmL。

全文数据：诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物及方法技术领域本发明涉及细胞的诱导方法，特别涉及诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物及方法。背景技术当大脑受损或发生疾病时，神经元通常会死亡或发生退行性病变，而星形胶质细胞则会被激活增生，被称之为应激性星形胶质细胞。这些应激性星形胶质细胞起初构筑成一道防护墙，阻止细菌和细胞因子及毒素进一步侵袭周围健康组织。但最终他们形成的胶质疤痕却阻止神经元再生。如何将星形胶质细胞诱导成功能性神经元用于神经修复，一是项具有挑战的工作。发明内容本发明的目的在于提供诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物及方法。本发明所采取的技术方案是：诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物，该组合物中含有可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路的化合物。进一步地，化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。进一步地，组合物中含有SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个。进一步地，组合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。化合物在制备将星形胶质细胞诱导成功能性神经元诱导剂中的应用，其中，化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路。进一步地，化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。进一步地，化合物选自SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个；优选的，化合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的方法，包括使用可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路的化合物处理星形胶质细胞。进一步地，化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。进一步地，化合物选自SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个；优选的，化合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。本发明的有益效果是：本发明技术可以将活化的胶质细胞以及胶质疤痕转化成功能性神经元来防治脑退化和脑损伤，将可能带动传统抗衰老保健品产业及重大脑疾病治疗上的革新。附图说明图1是小分子化合物SYC将成年小鼠大脑中胶质细胞转化神经元的实验结果；图2是小分子药物SYC将成年小鼠大脑中胶质细胞转化功能神经元的实验结果。具体实施方式本发明中筛选的药物有SB431542，Repsox，LDN193189，dorsomorphin，DAPT，CHIR99021，Thiazovivin，Y27632，SmoothenedagoinistSAG，purmorphamine，TTNPB，retinoicacid，valproicacidVPA，forskolin，ISX9等二十几种与胶质细胞到神经元转化相关的小分子药物，FGF2，BDNF，GDNF，EGF等生长因子。通过不同的化合物组合进行筛选。经过离体细胞培养平台筛选，最终确定现有最优组合能够将胶质细胞转化为神经元，其它组别不是细胞凋亡严重就是跟对照组相比没有变化。因此，最终确定这六种小分子化合物SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和一种生长因子FGF2在活体动物中进行实验，发现在活体内同样可以将活化的胶质细胞转化为功能性的神经元。下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。以下实验中，使用的小分子化合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。免疫荧光染色小鼠用戊巴比妥钠50mgkg麻醉后，灌流，取脑，4％PFA4℃固定过夜。然后依次置于15％和30％蔗糖溶液中，用莱卡冰冻切片机切片，厚度为40μm。脑片用封闭液封闭2h，之后加一抗过夜孵育，PBS洗3次，孵育二抗，固定，拍照。封闭液组成成分为2.5％羊血清、2.5％驴血清和0.3％TritonX-100，溶于PBS，pH7.4。小鼠海马脑片的制备将实验动物脱颈致死，迅速取出脑浸入冰水混合的切片液Cuttingsolution中，Cuttingsolution包含mM：92NaCl、2.5KCl、1.2NaH2PO4、30NaHCO3、20HEPES、25Glucose、5Sodiumascorbate、2Thiourea、3Sodiumpyruvate、10MgSO4·7H2O和0.5CaCl2·2H2O，渗透压调至300-310mOsm，pH＝7.3～7.4。用震动切片机在冰水混合的Cuttingsolution中将脑切成350μm厚的脑片，然后将脑片放入装有33℃人工脑脊液NMDG-HEPESRecoverySolutionACSF中，包含mM：93NMDG、93HCl、1.2NaH2PO4、30NaHCO3、20HEPES、25Glucose、5Sodiumascorbate、2Thiourea、3Sodiumpyruvate、10MgSO4·7H2O和0.5CaCl2·2H2O，渗透压调至300-310mOsm，pH＝7.3～7.4，孵育12min，孵育过程通入95％的O2和5％的CO2的混合气。之后把脑片转移至另一种人工脑脊液中ModifiedHEPESHoldingACSF，包括92NaCl、2.5KCl、1.2NaH2PO4、30NaHCO3、20HEPES、25Glucose、5Sodiumascorbate、2Thiourea、3Sodiumpyruvate、2MgSO4·7H2O和2CaCl2·2H2O，渗透压调至300-310mOsm，pH＝7.3～7.4脑片孵育直至始进行膜片钳记录，孵育过程通入95％的O2和5％的CO2的混合气。然后再标准人工脑脊液中进行全细胞记录，包括124NaCl、2.5KCl、1.2NaH2PO4、24NaHCO3、5HEPES、12.5Glucose、2MgSO4·7H2O和2CaCl2·2H2O，渗透压调至300-310mOsm，pH＝7.3～7.4脑片进行膜片钳记录时，通入95％的O2和5％的CO2的混合气的人工脑脊液以2mlmin的速度进行循环。电极阻抗为3–5MΩ，串联电阻为20-40MΩ。同时记录转化的神经元和小鼠原有神经元用pClamp10记录数据，采样率10kHz，1kHz过滤，Clampfit和Synaptosoft软件分析数据。实验动物活体脑部微量注射小分子药物将成年小鼠2月龄置于无菌的立体定位仪上，使用异氟烷麻醉动物，固定动物后，使用75％酒精进行消毒，暴露颅骨，根据小鼠脑图谱确定小鼠海马，颅骨钻开洞。手术完毕后，将AAV9-GFAP-promoter-Cre和AAV9-CAG-promopter-mCh-Flex混合病毒注入海马及皮层将应激性星形胶质细胞特异性的标记为红色细胞，7天之后再次往同样位置注射小分子药物。整个手术操作过程，进行无菌处理，小鼠恢复后，放回动物房饲养。实验结果1.小分子药物将成年动物脑内的星形胶质细胞转化成为神经元小分子药物诱导星形胶质细胞转化为神经元的策略为抑制相关信号通路使其在星形胶质细胞状态不稳定，再促进神经元发生相关信号通路激活，最终实现从星形胶质细胞转化神经元。在小分子药物组合代号：SYC，处理21天之后，发现对照组红色荧光蛋白标记的星形胶质细胞仍旧表达星形胶质细胞的特异性标志物胶质纤维酸性蛋白GFAP，而实验组小鼠脑切片免疫荧光染色表明，红色标记的星形胶质细胞已经表达神经元特异性标志物神经元核NeuN，同时不再表达星形胶质细胞的特异性标志物GFAP图1。图中，A、实验操作流程；B、对照组海马CA1脑区免疫染色结果，红色：特异性标记星形胶质细胞荧光蛋白；绿色：免疫荧光染色的星形胶质细胞特异性标志物GFAP；C、实验组皮层Cx、CA1、CA3脑区免疫染色结果，红色：特异性标记星形胶质细胞荧光蛋白；白色：免疫荧光染色的星形胶质细胞特异性标志物GFAP；绿色：神经元特异性标志NeuN。比例尺：20μm。2.小分子药物将成年动物脑内的星形胶质细胞转化成为具有功能的神经元小分子药物诱导出的神经元是否具有电生理功能需要用膜片钳进行全细胞记录检测神经元是否具有电活动。通过比较，发现转化出的神经元在21天时具有中间态特殊放电活动，而到60天时基本处理正常生理状态，而对照组仍旧是星形胶质细胞，没有放电活动，无法产生编辑神经信号的动作电位图2。图中，A、对照组，星形胶质细胞全细胞记录的钠钾电流和动作电位，并无动作电位发放；B、小分子药物处理位置的对侧大脑半球，神经元钠钾电流正常且动作电位发放正常；C、小分子药物处理21天后的全细胞记录，处理中间过渡态的神经元全细胞记录展示神经元呈现过度兴奋状态；D、小分子药物处理60天后的全细胞记录，结果显示神经元不仅具有完整的电生理功能而且处理正常状态。

权利要求：1.诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的组合物，该组合物中含有可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路的化合物。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：组合物中含有SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：组合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。5.化合物在制备将星形胶质细胞诱导成功能性神经元诱导剂中的应用，其中，化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：化合物选自SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个；优选的，化合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。8.诱导星形胶质细胞成为功能性神经元的方法，包括使用可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路中的至少一个，抑制或关闭星形胶质细胞信号通路的化合物处理星形胶质细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：化合物可作用于糖原合成激酶-3βGSK-3β、转化生长因子TGF-β和骨形成蛋白BMP信号通路。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：化合物选自SB431542、CHIR99021、Forskolin、Y27636、DAPT、VPA和FGF2中的至少一个；优选的，化合物中SB431542浓度为200μM、CHIR99021浓度为100μM、Forskolin浓度为100μM、Y27636浓度为500μM、DAPT浓度为500μM、VPA浓度为50mM、FGF2浓度为2μgml。

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