申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2023-06-05

公开（公告）日：2023-12-08

公开（公告）号：CN117187349A

主分类号：C12Q1/6841

分类号：C12Q1/6841;C12Q1/6895

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.12.26#实质审查的生效;2023.12.08#公开

摘要：本发明公开了一种将ND‑FISH与GISH结合的百合杂交种鉴定方法，涉及生物基因工程检测技术领域。本发明提供了一种针对同一待测玻片连续进行ND‑FISH与GISH检测的百合杂交种鉴定方法，ND‑FISH技术能够将荧光显示在染色体的不同部分和不同信号强度，所以通过荧光标记技术可以进行区分近端染色体，且能够更加准确的进行配对。而在百合组间杂交种鉴定的过程中，用GISH技术进行鉴定工作能够对检测出亲本染色体和不同基因组之间的组间重组染色体，将两种技术进行结合能够精确定位亲本染色体在子代染色体中的位置，并且能够分析和观察百合杂交的遗传规律，为后续百合亲本基因定位到具体染色体以及百合染色体命名奠定基础。

主权项：1.一种将ND-FISH与GISH结合的百合杂交种鉴定方法，用于百合组间杂交种的鉴定，其特征在于，包括如下步骤：1发根及预处理：剪取待检测百合的根，并置于有孔且湿润的离心管中，采用笑气处理2～3h后，加入90％醋酸并于冰上固定10-15min，固定后的根用ddH2O清洗3～5次，加入70％酒精，于-20℃冰箱保存备用；2采用根尖中期细胞染色体进行制片：将步骤1中保存的根取出，用ddH2O清洗3-5次，加入适量ddH2O保持根的湿润状态，使用镊子将根取出并于滤纸上吸干水分，用刀片切下根尖分生区组织，放入预先准备好的2％纤维素酶和1％果胶酶混合液中，35～40℃水浴50～60min，酶解后的根尖立即转移到冰上放置，用70％酒精洗3～5次，再加入100μL的70％酒精，然后使用电动组织研磨器将根尖磨碎，3500rmin离心3min，倒掉酒精，倒扣于纸上晾干剩余酒精；接合管内根尖数，按照每个1个根尖加28μL冰醋酸的加料比加入冰醋酸，并且涡旋充分混匀；取10μL悬液滴在洁净载玻片上，并置于已经用水喷湿的片盒中自然晾干；然后在普通相差显微镜下观察有丝分裂中期细胞染色体，并用铅笔在载玻片侧面标记好分裂相的位置，保留分裂相较好的玻片；用紫外交联仪进行交联后，应用塑封袋包装好后，置于-20～4℃冰箱保存；3ND-FISH鉴定：在已知目的基因的前提下，选取重复序列选择30-57bp作为寡核苷酸探针序列，并利用TAMRA或FAM荧光基团在5’端进行修饰得到探针干粉，将探针干粉于12000rmin离心3min，按照1OD加100μL1×TE溶液的加料比加1×TE溶液进行溶解，得到100×的探针原液，然后用2×SSC：1×TE＝1:1Buffer将100×探针原液稀释成1000×的寡核苷酸探针工作液备用；根据杂交体系，取对应量的寡核苷酸探针工作液加入Buffer中，充分混匀，以制成探针杂交液，将10μL探针杂交液滴加到玻片上有分裂相的区域，迅速盖上盖玻片，放进提前预热好的湿润密闭铝盒中，置于42℃恒温培养箱中杂交2h；杂交后的玻片用42℃预热的2×SSC溶液洗脱液进行洗脱，并用洗耳球迅速吹干玻片；在分裂相所在区域滴加8μL的DAPI抗褪色剂进行复染，盖上盖玻片；最后用荧光显微镜观察分裂相，并进行拍照以及图片合成；4染色体清洗：用75％酒精将已经拍摄完的玻片中含有分裂相的部位的DAPI抗褪色剂洗掉，并用洗耳球吹干，以便后续进行GISH试验；5探针标记：提取目的DNA和封阻DNA；避光条件下采用德国的JenaBioscience荧光探针–蛋白标记试剂盒对目的DNA进行标记得到目的基因组探针；6GISH鉴定：首先，将步骤4清洗后的片子依次洗涤或放紫外交联仪处理一遍，洗涤过程为：用2×SSC洗5min，3:1的无水乙醇醋酸洗10min再继续利用2×SSC洗两遍，每遍洗5min，4％formaldehydesolution洗10min，2×SSC洗3遍，每遍5min，70％、85％90％梯度酒精各洗1min；然后在避光条件下进行如下操作：将0.7ul目的基因组探针加入9.3ul杂交液并混匀得到混合液，所述杂交液由1g硫酸葡聚糖钠盐、2mlddH20、5mlFA、1ml20×SSC、1ml鲑鱼精DNA组成；将混合液90℃变性10min，随后立即将混合液冰埋，待混合液温度降至室温以下后，加入3ul封阻基因组混匀，将13ul的混合液滴到玻片上，加盖盖玻片，将片子85℃变性5min，随后50℃孵化过夜，第二天50℃下采用2×SSC洗10min，洗的过程中每隔3分钟将片子上下涮一下，随后利用ddH20和无水乙醇各洗1min晾干滴加8ulDAPI抗褪色剂，加盖盖玻片后镜检拍照；7采用imageProPlus软件对步骤3以及步骤6所得图片进行测量，并根据测量结果，利用PowerPoint进行染色体模型图的绘制，根据模型图精确定位亲本染色体和重组染色体情况。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川农业大学 一种将ND-FISH与GISH结合的百合杂交种鉴定方法

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