申请/专利权人：兆丰华生物科技(福州)有限公司;兆丰华生物科技(南京)有限公司;兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心;北京科牧丰生物制药有限公司

申请日：2023-09-26

公开（公告）日：2023-12-29

公开（公告）号：CN117310185A

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/569;C07K14/30;C12N15/70;C12N15/31

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.01.16#实质审查的生效;2023.12.29#公开

摘要：本发明公开了一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法。猪肺炎支原体在培养过程中因为葡萄糖消耗量的变化，导致培养基中pH值的改变，进而出现颜色反应。当猪肺炎支原体特异性SIgA抗体与猪肺炎支原体结合后，导致能够消耗葡萄糖的猪肺炎支原体减少。因此，可依据棕红色的3‑氨基‑5‑硝基水杨酸在OD540nm吸光值的变化，进行剩余葡萄糖含量的测定，进而可以计算出培养基中猪肺炎支原体特异性SIgA抗体结合猪肺炎支原体后的葡萄糖的变化量。本发明依据标定出的已知浓度特异性SIgA抗体与猪肺炎支原体结合后培养基中剩余葡萄糖的含量制作曲线，即可计算出待检样本中特异性SIgA抗体的浓度。

主权项：1.一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）猪肺炎支原体培养物制备将猪肺炎支原体按照20%的接种比例接种于培养基中，得到猪肺炎支原体培养物；2）特异性SIgA抗体阴阳性对照的制备及标定2-1）特异性SIgA抗体阳性对照的制备：选取经猪肺炎支原体抗体和抗原检测均为阴性的25~30日龄仔猪，对猪只进行猪肺炎支原体活疫苗免疫，1头份只，2周后加强免疫1次，2头份只，加强免疫后4~6周采集肺泡进行特异性SIgA抗体的制备，收获的液体离心处理后，无菌处理，上清即为猪肺炎支原体特异性SIgA抗体阳性对照；2-2）特异性SIgA抗体阴性对照的制备：经猪肺炎支原体抗原和抗体检测均为阴性25~30日龄仔猪，取其肺进行肺泡液的灌洗、收集，将收获的液体离心，无菌处理，上清液即为猪肺炎支原体特异性SIgA抗体阴性对照；2-3）特异性SIgA的含量标定；采用已知浓度的SIgA对阳性对照中SIgA的含量进行标定；3）猪肺炎支原体抗体检测步骤：3-1）取1:10倍稀释的猪肺炎支原体培养物和无菌处理的待检样本，等比例混合后，37℃条件下，继续培养48h，同时，取另外3组猪肺炎支原体培养物，分别等比例加入已知不同浓度的特异性SIgA抗体阳性对照、阴性对照和PBS空白对照，37℃条件下，培养48h，按照步骤3-2）进行培养物中OD540nm吸光度的测定；3-2）培养结束后，分别向培养物中继续加入0.5mLDNS，充分混匀后，置沸水中加热煮10~12min，立即置冷水中处理，室温放置5~10min，加入2~5mL的纯化水，混匀后，540nm波长下测定吸光度，分别得到不同浓度的特异性SIgA抗体阳性对照存在条件下培养物中OD540nm值（P）、阴性对照存在条件下培养物中OD540nm值（N、PBS空白对照存在条件下培养物中OD540nm值（C），以及待测样本存在条件下培养物中的OD540nm值（S）；3-3）以特异性SIgA抗体阳性对照的浓度为横坐标，以不同浓度特异性SIgA抗体存在下，猪肺炎支原体培养物中OD540nm值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线方程和待检样本OD540nm值，计算出待检样本中特异性SIgA抗体的浓度。

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