申请/专利权人：湖南师范大学

申请日：2021-06-04

公开（公告）日：2024-01-12

公开（公告）号：CN113388639B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/89;C12N15/65;A01K67/0278;A61K49/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.01.12#授权;2022.04.01#实质审查的生效;2021.09.14#公开

摘要：本发明涉及基因敲入技术领域，特别是公开了一种基因敲入选育斑马鱼vmhc‑EGFP品系的方法。通过CRISPRCas9基因编辑技术和同源重组技术，首先，在斑马鱼基因vmhc终止密码子下游附近设计合适的打靶位点，利用体外合成特异性gRNA和Cas9蛋白按一定比例共注射斑马鱼1细胞期胚胎内，通过PCR测序分析该靶点有效性；根据斑马鱼vmhc基因的终止密码子上下游序列分别通过PCR扩增左右两个同源臂并分连接入质粒pMCS1‑2A‑EGFP‑MCS2（本实验室保存）克隆位点，即合成重组质粒pvmhc‑Left‑2A‑EGFP‑Right；利用该重组质粒，与gRNA和Cas9蛋白按一定比例注射进斑马鱼1细胞期胚胎内，待胚胎发育60h后，在荧光显微镜下观察胚胎心室组织中是否有绿色荧光蛋白特异表达，从而确定2A‑EGFP序列成功敲入vmhc基因的下游特定位点，并进一步通过PCR和Sanger测序鉴定。通过该构建的斑马鱼vmhc‑EGFP敲入品系可以在活体斑马鱼示踪vmhc基因的时空表达模式和表达水平，也可以直接观察分析斑马鱼心室形态结构变化。本发明实现了能有效且精确地在生物体基因组基因中的特定位点敲入外源基因；同时，利用该敲入品系可以作为心血管相关疾病研究以及药物筛选的一个理想实验模型。

主权项：1.一种基因敲入选育斑马鱼vmhcEGFP-KI品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：CRISPRCas9技术vmhc基因靶位点gRNA的设计与合成，通过NCBI和Ensembl在线软件，在斑马鱼vmhc基因最后一个外显子终止密码子处设计一个独特的靶位点，引物序列如下所示：F：TGTAATACGACTCACTATAGGTCAAGAGTAAAGCTCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC、R：AAGCACCGACTCGGTGCCACT；步骤2：斑马鱼vmhc基因靶位点gRNA有效性检测，按照以下步骤完成：（1）将Cas9蛋白和gRNA组成预混体系，进行胚胎显微注射；（2）随机挑选部分注射胚胎，利用PCR和Sanger测序检测靶位点有效性；步骤3：重组质粒pvmhc-Left-2A-EGFP-vmhc-Right的构建，按照以下步骤完成：（1）斑马鱼vmhc基因左右同源臂的选择与合成，利用引物对vmhc-Left-F：ggtcgaccactcccaggtatgctaaatgttt和vmhc-Left-R：gggatccgactcttgatcatgtcccttctgta合成左同源臂vmhc-Left，左同源臂位于靶位点上游；利用引物对vmhc-Right-F：ggcggccgctgtgtctccgttatgctgaatt和vmhc-Right-R：gctcgagtttggccgttatagtccagaaac合成右同源臂vmhc-Right，右同源臂位于靶位点下游；（2）纯化回收得到的左同源臂vmhc-Left与经Sal1和BamH1双酶切pMCS1-P2A-EGFP-MCS2后纯化回收的Sal1-BamH1-P2A-EGFP-MCS2连接得到pvmhc-Left-P2A-EGFP-MCS2；（3）纯化回收得到的右同源臂vmhc-Right与经Not1和Xho1双酶切pvmhc-Left-P2A-EGFP-MCS2后纯化回收的vmhc-Left-P2A-EGFP-Not1-Xho1连接，即得到重组质粒pvmhc-Left-P2A-EGFP-vmhc-Right；步骤4：将Cas9蛋白、gRNA及重组质粒组成预混体系，进行胚胎显微注射；步骤5：在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

全文数据：

权利要求：

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