申请/专利权人：鄂尔多斯市中心医院(内蒙古自治区超声影像研究所)

申请日：2020-09-17

公开（公告）日：2024-01-26

公开（公告）号：CN112083172B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543;C12N15/70;C07K14/435;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.01.26#授权;2021.01.01#实质审查的生效;2020.12.15#公开

摘要：本发明提供了一种从蜱cDNA文库中筛选具有抗凝血活性的蛋白质的方法，属于生物技术领域。本发明提供的方法是在免疫学筛选方法基础上，利用抗凝血物质直接与凝血物质结合的特性，增加了与凝血因子物质相结合的步骤，实现针对特定的凝血因子筛选出具有特异性的抗凝血因子的蛋白。与常规免疫学筛选方法相比，本发明增强了筛选的特异性，而且对应的噬斑或者噬菌斑的位置不变，可以直接找到阳性噬斑，对阳性噬斑的基因片段进行扩增和其蛋白质的表达，从而得到具有抗凝血活性的蛋白质。本发明提供的方法筛选靶向性较强，且特异性高，可直接发现有抗凝血活性的功能蛋白。

主权项：1.一种从蜱cDNA文库中筛选具有抗凝血活性的蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：1将蜱cDNA噬菌体文库溶液和细菌液混合，将噬菌体细菌混合液与含10mMMgSO4的LB顶层琼脂糖培养基混合后倾倒在LB固体培养基平板表面，凝固后在40～42℃下倒置培养，得到形成噬菌斑的平板；2用浸泡有IPTG的NC膜平铺于所述形成噬菌斑的平板的表面，在37～38℃条件下转膜，得到包被有抗凝血活性的蛋白质的NC膜；所述IPTG的浓度为10mM；3对所述包被有抗凝血活性的蛋白质的NC膜封闭，得到封闭的NC膜；4将所述封闭的NC膜置于凝血因子溶液中孵育，得到结合有凝血因子的NC膜；所述凝血因子溶液中凝血因子的种类包括牛α凝血酶、人α凝血酶、牛凝血因子Xa或人凝血因子Xa；5将结合有凝血因子的NC膜依次置于抗凝血因子抗体溶液、酶标二抗溶液、显色液和终止液中，得到NC膜上阳性显色信号的位置；6根据NC膜上阳性显色信号的位置，挑取平板上对应位置的单一噬菌斑作为PCR扩增模板，采用通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；7将所述PCR产物经重组表达，得到具有体外抗凝血活性的蛋白质。

全文数据：

权利要求：

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