申请/专利权人：吉林农业科技学院

申请日：2023-10-26

公开（公告）日：2024-02-02

公开（公告）号：CN117487889A

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.02.23#实质审查的生效;2024.02.02#公开

摘要：本发明公开了基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法，具体检测方法步骤如下：步骤一：选取试验设备和转基因检测原料及辅料，检验人员对原材料进行检验，并且对试验设备及转基因检测设备进行试运行，并且向工作人员进行技术交底工作；步骤二：在Bar基因的序列由GenBank查询获得两端加入PstⅠ和FseⅠ的酶切位点；将pTRAux质粒进行双酶切反应；步骤三：在无菌区，向LB平板表面打入150μL的E.coliBL21DE3冻存菌，在37℃条件下，过夜培养，在5mLLB液体培养基中，接种培养完成的单菌落，放入事先设置好的培养箱中，振荡培养一夜。现有的快速检测玉米转bar基因方法不依赖于大型仪器且检测时间较短，结果鉴定简单，能实现可视化的检测。

主权项：1.基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法，其特征在于，具体检测方法步骤如下：步骤一：选取试验设备和转基因检测原料及辅料，检验人员对原材料进行检验，并且对试验设备及转基因检测设备进行试运行，并且向工作人员进行技术交底工作；步骤二：在Bar基因的序列由GenBank查询获得两端加入PstⅠ和FseⅠ的酶切位点；将pTRAux质粒进行双酶切反应；步骤三：在无菌区，向LB平板表面打入150μL的E.coliBL21DE3冻存菌，在37℃条件下，过夜培养，在5mLLB液体培养基中，接种培养完成的单菌落，放入事先设置好的培养箱中，振荡培养一夜，至OD600值达到0.4；步骤四：在步骤三的基础上将含有1mL菌液、45mL的LB培养基的锥形瓶放置其中培养3h，OD600值为0.4时，取出放入冰水中，用冰水混合物冰浴菌液30min，菌液放入事先调好的离心机中，离心15min，留下沉淀；步骤五：再步骤四产物中取预冷的0.1molLCaCl2溶液，吹散菌体，并迅速浸于冰面下，放置30min，将离心管放入离心机，离心12min，留取沉淀，再用2mL预冷的0.1molLCaCl2溶液，吹散沉淀，取200μL菌液与200μL已灭菌的40％甘油，混匀后，保存于零下80℃冰箱；步骤六：在步骤五制备的两管感受态细胞浸于冰水中，放置6min，并分为A、B两管，A管加入8μL连接产物，B管中加入8μLddH2O做阴性对照，混匀冰中放30min，将样本于42℃水浴锅中，精准的热激90sec，然后快速放回冰水中，放置5min；步骤七：在步骤六的基础中将800μLLB培养基加入每管，轻轻混匀，将样本放入设置好的培养箱中，培养45min，将其放入事先调好的离心机中，离心5min，保留100μL上清液，吹散沉淀，将其转移到LB平板含100ngμL终浓度的壮观霉素上，均匀涂满整表面，正向放置于37℃培养箱中，培养30min，然后倒置培养过夜，筛选阳性质粒；步骤八：通过改良CTAB法进行基因组的提取并且进行LAMP引物的设计与筛选，最终进行LAMP反应体系的优化、LAMP灵敏度的验证、LAMP特异性的验证和LAMP实际样本验证。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 吉林农业科技学院 基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法

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