申请/专利权人：烟台鼎昊生物科技有限公司

申请日：2023-12-14

公开（公告）日：2024-02-06

公开（公告）号：CN117512139A

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明公开了一种RT‑qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法，以猪后腿膝关节软骨提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得II型胶原蛋白基因、I型胶原蛋白基因和内参基因的Ct值和溶解曲线，获得mRNA的相对表达值，根据相对表达值的大小定量检测细胞外基质的分泌能力，为研究软骨细胞体外分泌能力的研究提供技术支持，本发明检测成本低、特异性强，能够对多样本快速筛选，为后期构建组织工程支架提供筛选标准。

主权项：1.一种RT-qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法，其特征在于：以实时荧光定量PCR方法检测猪后腿膝关节总RNA中软骨细胞特异性蛋白基因序列，获得mRNA的相对表达值，根据相对表达值的大小定量检测细胞外基质的分泌能力，本检测方法包括以下步骤：步骤1：设计下列引物：猪关节软骨细胞II型胶原蛋白基因COL2A1特异性上、下游引物：COL2A1F：5'-GCTATGGAGATGACAACCTGGCTC-3'；COL2A1R：5'-CACTTACCGGTGTGTTTCGTGCAG-3'；猪关节软骨细胞I型胶原蛋白基因COL1A2特异性上、下游引物：COL1A2F：5'-ATACGCGGACTTTGTTGCTGCTTG-3'；COL1A2R：5'-TGTCCCTTCAATCCATCCAGACCA-3'；作为内参基因的猪TBP1基因的特异性上、下游引物：TBP1F：5'-AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA-3'；TBP1R：5'-AGATGTTCTCAAACGCTTCG-3'；其中，F代表上游引物，R代表下游引物；步骤2：合成猪软骨细胞cDNA第一链：2.1软骨细胞的提取：取新鲜猪软骨，置于PBS缓冲液中清洗剪碎，在浓度为0.01％的II型胶原酶中37℃消化14小时，离心后弃上清液，加入II型胶原酶继续37℃消化5小时，第一次收集细胞，再次加入II型胶原酶37℃消化3小时，再次收集细胞，将两次收集的细胞接种进行二维培养；2.2软骨细胞总RNA提取：细胞培养3天后，弃去原有培养基，PBS清洗一次后，用含有0.02％EDTA的胰蛋白酶37℃消化，在显微镜下观察细胞变化情况，待贴壁细胞变圆并脱落即可终止消化，收集细胞，取50万个细胞用动物RNA抽提试剂盒提取总RNA；2.3cDNA合成：按照反转录试剂盒说明书依次操作：在Microtube中依次加入1μg浓度为1μgμL的总RNA，1μL浓度为10mM的dNTP，12.5μLDEPC水，得混合试剂；将混合试剂置于65℃水浴中保持10分钟，然后置于冰浴中保持3分钟，加入OligodTPrimer1μL，5×PrimeScriptIIBuffer4μL，RNaseinhibitor0.5μL，RTase1μL，混匀后置于PCR仪中，条件依次为42℃保持60分钟，95℃保持5分钟，4℃保持10分钟，得猪软骨细胞cDNA第一链；步骤3：配置PCR反应体系：取2×SYBRGreenqPCRMix10μL，依次加入稀释10倍的cDNA第一链2μL、上游引物0.6μL、下游引物0.6μL，加ddH2O至20μL；步骤4：进行实时荧光定量PCR扩增：以步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA第一链为cDNA模板，以步骤1中的COL2A1上、下游引物、COL1A2上、下游引物以及TBP1上、下游引物为特异性引物，在步骤3中的PCR反应体系中进行荧光定量PCR扩增，根据荧光信号的数据，获得COL2A1、COL1A2及内参基因TBP1片段的Ct值及溶解峰；步骤5：将步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤1中的COL2A1上、下游引物、COL1A2上、下游引物以及TBP1上、下游引物为特异性引物，在步骤3的PCR反应体系中进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带软件建立COL2A1基因片段、COL1A2基因片段及内参基因TBP1的溶解曲线及标准曲线，得到COL2A1基因片段、COL1A2基因片段及内参基因TBP1的扩增效率、斜率及相关系数；所述相关系数用R2值表示；步骤6：将步骤5获得的PCR扩增产物COL2A1、COL1A2和TBP1基因片段测序，将测序所得核苷酸序列进行同源性比对。

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