申请/专利权人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院;中国农业科学院棉花研究所

申请日：2023-12-07

公开（公告）日：2024-02-09

公开（公告）号：CN117363644B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12Q1/66

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.09#授权;2024.01.26#实质审查的生效;2024.01.09#公开

摘要：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及VIGS沉默效率报告质粒、评价沉默效率的方法及应用。本发明通过将植物内源基因片段与双荧光素酶载体中的LUC基因形成融合表达基因，并使用组成型启动子诱导其表达得到VIGS沉默效率报告质粒pVSr。将该质粒与病毒载体共转化原生质体，如果包含植物内源基因片段的病毒载体诱导VIGS产生，LUC值会下降。因此通过LUCREN的酶活测定即可在1天内快速评价植物内源基因片段VIGS沉默效率。同时本发明还可以用于筛选促进或抑制植物VIGS的效应因子。因此本发明不仅可以用于VIGS实验，还可在原生质体的单细胞水平用于植物‑病毒互作以及植保等方向的研究。

主权项：1.VIGS沉默效率报告质粒在评价VIGS片段沉默效率中的应用；所述报告质粒由LUCREN双荧光素酶报告系统、启动子和多克隆位点组成；所述报告质粒中LUCREN双荧光素酶报告系统、启动子和多克隆位点的顺序为35s启动子、LUCREN双荧光素酶报告系统中的REN基因、终止子、Ubi启动子、多克隆位点和LUCREN双荧光素酶报告系统中的LUC基因和终止子；所述报告质粒的载体骨架为：pGreenII0800-Luc；所述多克隆位点用于插入目的基因；所述多克隆位点插入的目的基因为：基因的全长编码区序列或包含VIGS载体中待沉默目的基因的片段序列；所述目的基因还包括删除终止密码子的处理；所述目的基因与LUCREN双荧光素酶报告系统中的LUC基因置于同一个蛋白编码框中；所述蛋白编码框的启动子为Ubi启动子;所述VIGS沉默效率报告质粒评价VIGS片段沉默效率的方法为以下步骤：将报告质粒分别与VIGS对照质粒和VIGS沉默目的基因的质粒进行共转化原生质体处理；在12~24h时收集经过转化的原生质体，将经过转化的原生质体与裂解液混合后测定LUC和REN的酶活性，通过比较VIGS对照质粒的经过转化的原生质体和VIGS沉默目的基因质粒的经过转化的原生质体的LUCREN比值确认内源片段的沉默效率。

全文数据：

权利要求：

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