申请/专利权人：北京维德维康生物技术有限公司

申请日：2020-04-13

公开（公告）日：2024-02-20

公开（公告）号：CN111273018B

主分类号：G01N33/58

分类号：G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/53

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.20#授权;2020.07.07#实质审查的生效;2020.06.12#公开

摘要：本发明公开了一种检测溴敌隆的ELISA方法及其试剂盒，本发明所提供的检测溴敌隆的酶联免疫试剂盒由酶标板（包被式I溴敌隆药物半抗原与载体蛋白的偶联物）、抗体工作液（含溴敌隆药物单克隆抗体）、酶标记物工作液（含辣根过氧化物酶标记的抗溴敌隆药物单克隆抗体的抗抗体）、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度溴敌隆标准品溶液、底物显色液、终止液组成。本发明所提供的溴敌隆检测试剂盒可用于食品中毒物的检测，还可用于人血清检测，在猪肉、牛奶、血清中的溴敌隆的检测限为5μgkg，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。

主权项：1.一种检测溴敌隆的酶联免疫试剂盒，包括：溴敌隆检测酶标板、溴敌隆系列标准品工作液、溴敌隆抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液和终止液，其特征在于：所述溴敌隆检测酶标板由溴敌隆药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成，溴敌隆药物半抗原为式I所示化合物： 所述溴敌隆药物半抗原的制备方法包括如下步骤：称取500mg溴敌隆用6mL吡啶溶解，加入邻苯二甲酸酐154.45mg，加热至60℃搅拌，纯化，旋干，终止反应，得到式I所述化合物；所述溴敌隆抗体为溴敌隆药物的特异性抗体；所述溴敌隆药物的特异性抗体为所述溴敌隆单克隆抗体，所述溴敌隆单克隆抗体由重链和轻链组成，所述重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列1所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示；所述溴敌隆抗体工作液为将溴敌隆的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有溴敌隆药物的单克隆抗体的抗体工作液；所述抗体稀释液为含有Proclin300和TritonX-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin300和TritonX-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072gL、0.59gL、8.5gL、0.4gL、200μLL和500μLL；所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶标记的抗溴敌隆药物单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍获得的；所述抗抗体稀释液为含有小牛血清和Proclin300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072gL、0.6gL、16gL、0.4gL、50mLL和200μLL；所述溴敌隆系列标准品工作液为6种溴敌隆标准品工作液，溶液的溶剂为含有光稳定剂和牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为溴敌隆；所述溶质在所述6种溴敌隆标准品工作液中的浓度分别为0μgL、0.15μgL、0.45μgL、1.35μgL、4.05μgL、12.15μgL；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂和牛血清白蛋白，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68gL、0.1gL、4gL、0.1gL、0.2gL和0.1gL，pH值为7.2；所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68gL、0.1gL、4gL、0.1gL、0.2gL、0.1gL和0.1gL，pH值为7.2；所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68gL、0.1gL、4gL、0.1gL、0.2gL、0.1gL和0.2gL，pH值为7.2；所述洗涤液为含有吐温20和Proclin300的PBS缓冲液；所述洗涤液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20和Proclin300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为23.2gL、2.0gL、64gL、0.036gL、20mLL和300μLL；所述底物显色液为1.0gL过氧化脲、5.0gL乙酸钠、0.5gL光稳定剂、2.5mLL磷酸和5.0gL四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水；所述终止液为0.05molL的硫酸水溶液。

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