申请/专利权人：浙江省农业科学院

申请日：2021-09-28

公开（公告）日：2024-02-20

公开（公告）号：CN113817854B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/6844;C12R1/42

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.20#授权;2022.01.07#实质审查的生效;2021.12.21#公开

摘要：本发明公开了一种单标记单链DNAssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法。通过RPA对沙门氏菌的特征基因进行扩增，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合RPA扩增的特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对单荧光标记的ssDNA进行切割，使其被GO吸附的能力减弱，而无沙门氏菌DNA的样本因为不激活Cas12a的附属切割活性，单荧光基团标记的ssDNA无法被切割，被GO吸附而出现荧光淬灭；最终将沙门氏菌的基因信息转换为可视的荧光变化。本发明实现了对沙门氏菌基因的特异、单标记、可视化检测。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取待测样品的基因组DNA；2）表达并纯化Cas12a；3）设计并合成RPA引物和crRNA；4）RPA扩增：以步骤1）提取的基因组DNA作为模板，在含有RPA引物的RPA体系中进行扩增，得到RPA产物；5）荧光可视检测：将步骤4）的RPA产物、步骤2）的Cas12a、步骤3）的crRNA、单荧光基团标记的ssDNA探针和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10~60min，再添加GO，通过荧光信号判断待测样品中是否含有沙门氏菌基因；所述的单荧光基团标记的ssDNA探针为：AAAAAAAAAAAA-FAM；所述步骤5）中：当RPA产物中含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割荧光基团标记的ssDNA探针，使其无法被GO吸附，溶液发射荧光；当RPA产物中不含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，无法切割荧光基团标记的ssDNA，使其被GO吸附，溶液不发射荧光。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江省农业科学院 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

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