申请/专利权人：上海原科实业发展有限公司

申请日：2018-08-16

公开（公告）日：2024-02-23

公开（公告）号：CN109082458B

主分类号：C12Q1/56

分类号：C12Q1/56

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.23#授权;2019.01.18#实质审查的生效;2018.12.25#公开

摘要：一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，包括缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂；制备方法包括：配制缓冲液、凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、生物防腐液、兔脑凝脂储备液；取支持剂加入缓冲液配制成支持液；按试剂盒规格要求将凝血因子Xa、凝血因子活化剂、兔脑凝脂储备液加到支持液中，混匀后加入生物防腐液、再加入缓冲溶液至规定量，混匀后分装冻干。本发明能通过血栓弹力图检测法，方便准确地对样本中的口服凝血因子Xa抑制剂进行定量检测，样本采用全血，无需进行额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验流程，方便了医生和患者，极具推广应用价值。

主权项：1.一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，其特征在于，包括：缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂；所述缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述凝血因子活化剂为Russell’s蛇毒RVV-V，所述支持剂包括NaCl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，所述生物防腐剂为液体生物防腐剂Proclin300；所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒由包括最终浓度分别为：50mmolL且pH值为7.4的4-羟乙基嗪乙磺酸液，15mgL的凝血因子Xa液，5mgL的兔脑凝脂液，6mgL的Russell’s蛇毒RVV-V液，以及150mmolL的NaCl液、5gL的甘氨酸液、20gL的牛血清白蛋白液、25gL的海藻糖液组成的支持液，体积百分浓度为0.05％的Proclin300防腐液混合冻干而成。

全文数据：一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒及其制备方法技术领域本发明涉及一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒及其制备方法，属于医疗器械技术领域。背景技术血栓性疾病是一种常见的心脑血管疾病，是由血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，使主要脏器发生缺血和梗死而引发机能障碍的各种疾病，在临床上常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死及静脉血栓栓塞等；目前，临床上治疗血栓性疾病的药物主要有抗血小板药物、溶血栓药和抗凝血药物三大类；由于传统的抗凝血药物在临床使用中的局限性，新型口服抗凝药物如凝血因子Xa抑制剂等成为了研究热点并逐步走向临床。凝血因子X英文为：CoagulationFactorX；简称：FX是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，其基因位于第13号染色体13q34，含8个外显子和7个内含子，8个外显子分别编码FX的7个结构功能区。FX活化为FXa时，重链N端Arg52和Ile53之间的肽键被切断，掉下一52氨基酸肽；FⅨa、FⅧa、Ca2+和磷脂复合物FⅦa、组织因子、Ca2+复合物可激活FX；此外，Russell’s蛇毒RVV、锯鳞蝰蛇毒SSVV、肿瘤坏死因子等也可激活FX；FXa是参与血液凝固过程的关键蛋白组分，也是抗血栓药物的重要靶点，其生理抑制剂主要是抗凝血酶ⅢAT-Ⅲ、α1-抗胰蛋白酶α1-AT和α2-巨球蛋白α-MG。FX活性缺乏或减少见于先天性和获得性缺乏症，FX活性增高主要见于高凝状态和血栓栓塞性疾病。Xa因子属于丝氨酸蛋白酶，其在凝血瀑布反应中有着重要作用，可通过内、外源性凝血路径予以激活，其所处位置的特殊性直接决定自身的重要性。利伐沙班、阿哌沙班和依度沙班等是口服Xa因子抑制剂，通常为固定剂量，目前尚没有专门的剂量监测试验；利伐沙班是全球第一个直接Xa因子抑制剂，能高度选择性地直接抑制呈游离或结合状态的Xa因子，产生抗凝作用，具有生物利用度高、治疗疾病谱广、量效关系稳定、口服方便和出血风险低等特点；作为新型抗凝药物，利伐沙班通过口服吸收，药效持久，一天可只服药一次，其治疗窗宽且无需常规凝血功能监测，这些优势使利伐沙班成为抗心脑血管和血液系统疾病的新宠。但新型抗凝药物的使用过程中，亦存在着一定的出血风险，尤其在使用剂量较大或在合并肝肾功能严重异常的患者身上使用时，出血和凝血功能障碍都是不可忽视的严重问题。因此，口服Xa因子抑制剂类新型抗凝药物的剂量监测已成为亟需解决的问题。现有技术中，Xa因子抑制剂常用检测方法包括：1凝血酶原时间PT：PT检测模仿外源性凝血的全部条件，反映外源性凝血是否正常，成人为参考值11～15秒，检测时，要求整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的；现有的不同PT试剂对利伐沙班的敏感性差异大，目前临床上常用的检测PT方法为比浊凝固法，与利伐沙班血药浓度的相关性差；采用NeoplastinPlus法测定PT评估利伐沙班的抗凝作用，该方法使用的检验试剂国际敏感度指数internationalsensitivityindex，ISI比较高，与血浆利伐沙班血浆浓度相关性好，呈剂量依赖性。2抗Xa因子活性测定：抗Xa因子对浓度＞30μgL的利伐沙班可以准确定量，如果有临床指征，建议采用显色底物法抗Xa因子活性测定利伐沙班血浆浓度，但检测时，也要求整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的；经利伐沙班血浆校准后的抗Xa因子，能准确反映治疗范围内利伐沙班的药物浓度，相关性强，敏感度优于PT，也是首选推荐的检测方法；目前，已有一些中心开展了此类检测，但尚无有效的参考值范围指导临床。综上所述，现有技术中，采用PT或抗Xa因子活性检测时，只有当整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，才能准确测量Xa因子抑制剂水平，但试剂和仪器仍然会影响Xa因子抑制剂的敏感性，导致实验室之间最终结果会有多达四倍的差异；此外，PT和抗Xa活性检测仅适用于检测血浆中Xa因子抑制剂的量，不能直接对全血进行检测，故不适用于床边检测。发明内容为解决现有技术的上述缺陷，本发明提供一种基于血栓弹力图法的口服凝血因子Xa抑制剂定量检测试剂盒及其制备方法，以全血为样本进行检测，且无需对样本进行额外处理也不要求凝血瀑布中的蛋白一定要保持完整，从而简化检验流程，适应所有口服凝血因子Xa抑制剂定量检测的需要。为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，其特征在于，包括：缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂。进一步的，所述缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述凝血因子活化剂为Russell’s蛇毒RVV-V，所述支持剂包括NaCl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，所述生物防腐剂为液体生物防腐剂Proclin300。进一步的，所述口服凝血因子Xa抑制剂定量检测试剂盒由包括最终浓度分别为：10～50mmolL且pH值为7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸液，10～30mgL的凝血因子Xa液，2～10mgL的兔脑凝脂液，2～10mgL的Russell’s蛇毒RVV-V液，由50～250mmolL的NaCl液、1～6gL的甘氨酸液、10gL～30gL的牛血清白蛋白液、12～40gL的海藻糖液组成的支持液，体积百分浓度为0.03％～0.05％的Proclin300防腐液混合冻干而成。一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒的制备方法，其特征在于，包括步骤：a将凝血因子Xa、凝血因子活化剂配制成浓度较高的凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液，将缓冲剂配制成缓冲液并将缓冲液pH值调节至7.0～8.0，将生物防腐剂配制成生物防腐液；b取兔脑凝脂加入少量缓冲液研磨至乳状后再加入缓冲液配制兔脑凝脂储备液；c取支持剂加入缓冲液配制成支持液；d分别量取凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液加入到支持液中，混匀，加入生物防腐液后再混匀，再加入缓冲溶液至规定量，混合均匀后分装冻干，即成所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒。与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明提供的一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒及其制备方法，通过缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂的配伍组合，能够通过血栓弹力图检测法，方便准确地对样本中的口服凝血因子Xa抑制剂进行定量检测，样本采用全血，无需进行额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验操作流程，方便了医生和患者，极具推广应用价值。附图说明图1为利伐沙班浓度-ACT值校准曲线图；图2为实测利伐沙班浓度与理论利伐沙班浓度关系图。具体实施方式下面结合附图以及附图说明和实施例对本发明提供的技术方案做进一步详细说明。需要说明的是，以下实施例所涉及的缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂及其他试剂皆市售可得。实施例1S11称取0.596g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸英文简称：HEPES放入250ml容量瓶中，用适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1molL的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为10mmolL且pH值为7.9左右的HEPES缓冲液；S12吸取1ml蒸馏水复溶凝血因子Xa冻干粉，制成浓度为1gL的凝血因子Xa储备液；S13吸取1ml蒸馏水复溶凝血因子活化剂RVV-V冻干粉，制成浓度为1gL的凝血因子活化剂RVV-V储备液；S14称取50mg兔脑凝脂并加入50ml的HEPES缓冲液，研磨至乳状且肉眼观察无明显颗粒，制成浓度为1gL的兔脑凝脂储备液；S15称取0.467g的NaCl、0.2g的甘氨酸、1.0g的牛血清白蛋白英文简称：BSA、1.5g的海藻糖，放入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；S16吸取0.8ml凝血因子Xa储备液、0.25ml凝血因子活化剂储备液、0.3ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；S17吸取30μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.03％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；S18将上述试剂溶液进行分装，20μl瓶，冻干，即成规格为含8mgL凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒。实施例2S21称取1.489g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸放入250ml容量瓶中，用适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1molL的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为25mmolL且pH值为7.4左右的HEPES缓冲液；S22、S23、S24分别与实施例1中的S12、S13、S14相同；S25称取0.877g的NaCl、0.5g的甘氨酸、2.0g的牛血清白蛋白、2.5g的海藻糖，加入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；S26吸取1.5ml凝血因子Xa储备液、0.5ml凝血因子活化剂储备液、0.6ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；S27吸取50μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.05％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；S28将上述试剂溶液进行分装，20μl瓶，冻干，即成规格为含15mgL凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒。实施例3S31称取2.979g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸英文简称：HEPES放入250ml容量瓶中，加入适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1molL的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为50mmolL且pH值为7.1左右的HEPES缓冲液；S32、S33、S34分别与实施例1中的S12、S13、S14相同；S35称取1.695g的NaCl、0.6g的甘氨酸、3.0g的牛血清白蛋白、3.8g的海藻糖，加入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；S36吸取2.5ml凝血因子Xa储备液、0.8ml凝血因子活化剂储备液、0.9ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；S37吸取40μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.04％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；S38将上述试剂溶液进行分装，20μl瓶，冻干，即成规格为含25mgL凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒。效果实施例本效果实施例通过HaemoscopeTEG5000血栓弹力图仪对口服凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度的检测进行说明。S41检测试剂盒规格及其组成：本效果实施例采用规格为含15mgL凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒进行试验说明，所述试剂盒组成包括：缓冲液：50mmolLHEPES，pH＝7.4；Xa因子：15mgL；兔脑凝脂：5mgL；RVV-V：6mgL；NaCl：150mmolL；甘氨酸：5gL；BSA：20gL；海藻糖：25gL；Proclin300：体积百分浓度0.05％。S42利伐沙班校准品的制备：首先配制包含体积百分浓度分别为0.05％的防腐剂Proclin300、质量体积百分浓度为0.5％的甘氨酸和0.5％的海藻糖组成的基础溶液，然后将利伐沙班标准品添加至正常血浆中，制成含有利伐沙班浓度分别为0、50、100、250、500μgL的校准溶液，分别分装，1ml瓶，冻干，即成利伐沙班系列校准品。S43凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度定量检测方程的建立：S431将含15mgL凝血因子Xa的本发明所述试剂盒和上述沙班系列校准品从2～8℃的贮存环境中取出，室温平衡15～30分钟，分别加水复溶；S432在血栓弹力图仪上选择“CRT”，装载检测杯，将10μl复溶后的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒复溶液注入检测杯中，再加入20μl的0.2molL的CaCl2溶液；再从上述利伐沙班系列校准品中的一个校准品复溶液中吸取340μL加至检测杯中，用移液器上下混吸3次，然后立即测试，记录其ACT数值；依此方法对该浓度的利伐沙班校准品复溶液再重复检测1次并记录其ACT数值；按上述方法依次对不同利伐沙班浓度的校准品复溶液进行检测，获得利伐沙班浓度分别为0、50、100、250、500μgL的校准品复溶液的各两个ACT数值；S433以不同利伐沙班浓度校准品复溶液各两次测得的ACT数值的均值为纵坐标，对应的利伐沙班浓度为横坐标，作图，得到如图1利伐沙班浓度-ACT值校准曲线图中所示的“利伐沙班浓度-ACT值校准曲线”；S434根据上述“利伐沙班浓度-ACT值校准曲线”可得“利伐沙班浓度-ACT值直线方程”，本实施例中，利伐沙班浓度-ACT值直线方程为：y＝0.4666x+100.61，相关系数r2＝0.997；根据上述“利伐沙班浓度-ACT值直线方程”，可得“利伐沙班浓度方程”为：x＝y-100.610.4666；其中：y为检测样本ACT值s，x为检测样本中利伐沙班浓度μgL。S44凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度的定量检测：在血栓弹力图仪上中选择“CRT”，装载检测杯，将10μl复溶后的本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒复溶液注入检测杯中，再加入20μl的0.2molLCaCl2溶液；从枸橼酸化的全血样本中吸取340μL加至检测杯中，用移液器上下混吸3次，然后立即测试，记录其ACT数值；将上述样本的ACT值代入“利伐沙班浓度-ACT值直线方程”或“利伐沙班浓度方程”中，即可得出样本中凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的浓度。S45本发明提供的试剂盒分析性能评估：S451线性范围：将接近线性范围上限、含利伐沙班浓度为495μgL的高浓度利伐沙班样本用血浆分别按45、35、25、15的比例稀释，并以血浆为空白样本，加上稀释前原样本，共得到6份不同活性浓度的样本；使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按步骤S42、S43、S44进行凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度的测定，将测定所得凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的实际稀释浓度与理论稀释浓度进行线性回归分析，可得回归计算方程为：y’＝1.0413x’-7.7143，相关系数r’2＝0.997；从图2所示的实测沙班浓度与理论利伐沙班浓度关系图中可以看出，本发明提供的试剂盒在凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度为0～495μgL的线性范围内相关性较好。S452最低检出限：以血浆为空白样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42、S43、S44所述步骤重复测定20次，计算空白样本ACT均值和标准差SD，以空白均值加标准差代入“利伐沙班浓度方程”中，计算最低检测限，其结果如表1所示：表1伐沙班浓度最低检出限表1结果显示：本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒的最低凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的检测限为49.56μgL，能够满足凝血因子Xa抑制剂最低检出限要求。S453重复性：用上述利伐沙班系列校准品中的一个样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42、S43、S44所述步骤重复测定10次，计算样本的ACT均值和SD值，得到变异系数CV％，结果如表2所示：表2普通肝素重复性试验检测数据表2结果显示：本发明所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒的检测口服凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的ACT变异系数CV不大于10％。需要说明的是：上述效果实施例虽然仅对采用HaemoscopeTEG5000血栓弹力图仪对口服凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度检测的效果进行了说明，但本发明所提供的血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒不仅适用于HaemoscopeTEG5000血栓弹力图仪，而且还适用于其它品牌、型号的血栓弹力图仪，如西芬斯CFMS血栓弹力图仪等，当然，具体检测参数应根据仪器不同进行适当调整；因相关的检测操作及效果相同或相似，故本说明书不再另外进行详细说明；此外，本试剂盒不仅适用于利伐沙班，还适用于其他沙班类凝血因子Xa抑制剂，如阿哌沙班、依度沙班等的定量检测，实验表明，本发明提供的血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒对其他沙班类凝血因子Xa抑制剂的定量检测能够达到与对利伐沙班定量检测的相同效果。综上所述：本发明提供的一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒及其制备方法，通过缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂的配伍组合，能够通过血栓弹力图检测法，方便准确地对样本中的口服凝血因子Xa抑制剂进行定量检测；实验表明，本发明提供的试剂盒在凝血因子Xa抑制剂利伐沙班浓度为0～495μgL的线性范围内相关性较好；凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的最低检测限为49.56μgL，能够满足凝血因子Xa抑制剂最低检出限要求；检测口服凝血因子Xa抑制剂利伐沙班的ACT变异系数CV不大于10％，显示其对口服凝血因子Xa抑制剂进行检测时具有良好的重复性；此外，利用本发明提供的血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒检测时，样本采用全血，无需进行额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验操作流程，方便了医生和患者，因此，极具推广应用价值。最后，有必要强调的是：上述内容仅用于帮助说明和理解本发明的技术方案，不能理解为对其的限制；本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

权利要求：1.一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，其特征在于，包括：缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂。2.如权利要求1所述一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，其特征在于：所述缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述凝血因子活化剂为Russell’s蛇毒RVV-V，所述支持剂包括NaCl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，所述生物防腐剂为液体生物防腐剂Proclin300。3.如权利要求1所述一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒，其特征在于：由包括最终浓度分别为：10～50mmolL且pH值为7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸液，10～30mgL的凝血因子Xa液，2～10mgL的兔脑凝脂液，2～10mgL的Russell’s蛇毒RVV-V液，以及50～250mmolL的NaCl液、1～6gL的甘氨酸液、10gL～30gL的牛血清白蛋白液、12～40gL的海藻糖液组成的支持液，体积百分浓度为0.03%～0.05%的Proclin300防腐液混合冻干而成。4.一种血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒的制备方法，其特征在于，包括步骤：a）将凝血因子Xa、凝血因子活化剂配制成浓度较高的凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液，将缓冲剂配制成缓冲液并将缓冲液pH值调节至7.0～8.0，将生物防腐剂配制成生物防腐液；b）取兔脑凝脂加入少量缓冲液研磨至乳状后再加入缓冲液配制成兔脑凝脂储备液；c）取支持剂加入缓冲液配制成支持液；d）分别量取凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液加入到支持液中，混匀，加入生物防腐液后再混匀，再加入缓冲溶液至规定量，混合均匀后分装冻干，即成所述血栓弹力图法定量检测口服凝血因子Xa抑制剂试剂盒。

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