申请/专利权人：KWS种子欧洲股份公司

申请日：2015-08-28

公开（公告）日：2024-02-27

公开（公告）号：CN106998665B

主分类号：C12N15/29

分类号：C12N15/29;A01H1/08;A01H5/00;A01H5/06;A01H5/10;C07K14/415;C12N15/82

优先权：["20140828 EP 14182719.6","20141223 EP 14004389.4"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.27#授权;2017.08.25#实质审查的生效;2017.08.01#公开

摘要：本发明涉及非转基因和转基因植物，优选农作物，其包含导致着丝粒组蛋白H3CENH3的CATD结构域、优选CATD结构域的环1或者α2‑螺旋中氨基酸序列改变的突变，所述植物具有单倍体诱导物的生物活性。进一步地，本发明提供产生本发明的植物的方法，可通过将本发明的植物与野生型植物杂交获得的单倍体和双单倍体植物，以及促进细胞质交换的方法。

主权项：1.编码包含CATD结构域的着丝粒组蛋白H3CENH3蛋白质的核苷酸序列用于产生具有单倍体诱导物生物活性的植物的用途，其中所述核苷酸序列包含在CATD结构域中导致CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，所述改变赋予单倍体诱导物生物活性，其中所述突变导致选自以下的氨基酸取代：在SEQIDNo.38的位置130的氨基酸亮氨酸被取代为苯丙氨酸；在SEQIDNo.52的位置153的氨基酸半胱氨酸被取代为酪氨酸；和在SEQIDNo.52的位置154的氨基酸丙氨酸被取代为缬氨酸。

全文数据：单倍体植物的产生[0001]本发明涉及非转基因和转基因植物、优选农作物，其包含导致着丝粒组蛋白H3CENH3的CATD结构域内、优选在CATD结构域的环1和或α2-螺旋内的氨基酸改变的至少一个突变，所述植物具有单倍体诱导物生物活性。进一步地，本发明提供产生本发明植物的方法和可通过将本发明植物与野生型植物杂交获得的单倍体和双单倍体植物，以及促进细胞质交换的方法。[0002]单倍体的产生和使用是改良栽培植物的最有效的生物技术手段之一。单倍体对于培育者的优势是在双单倍体化，产生双单倍体植物之后的第一代中已经可以实现纯合性，不需要获得高度纯合性所要求的若干回交世代。进一步地，单倍体在植物研究和培育中的价值在于双单倍体的生成细胞是减数分裂的产物，由此所得群体组成了多样性重组体及同时遗传固定的个体的集合。因此，双单倍体的产生不仅提供了极有用的遗传变异性进行选择用于作物改良），而且还提供了有价值的方式以产生作图群体、重组近交系以及直接纯合instantlyhomozygous的突变体以及转基因株系。[0003]单倍体可以通过体外或体内方法获得。然而，许多物种和基因型对于这些方法是顽固的（recalcitrant。或者，通过交换着丝粒特异性组蛋白H3变体CENH3，也称作CENP-A的N末端区并将其与GFP融合（“GFP-尾部交换”（GFP-tailswapCENH3，显著改变所述蛋白质，在模式植物拟南芥Arabidopsisthaliana中产生单倍体诱导物株系（RaviandChan,Nature，4642010,615-618;Comai，L,"Genomeelimination:translatingbasicresearchintoafuturetoolforplantbreeding.〃，PLoSbiology,12.62014〇CENH3蛋白是H3组蛋白的变体，其是活性着丝粒的着丝点复合物的成员。使用这些“GFP-尾部交换”单倍体诱导物株系，当单倍体诱导物植物与野生型植物杂交时在后代中发生单倍体化。令人感兴趣地，单倍体诱导物株系在自交时是稳定的，提示在产生杂交胚中修饰的着丝粒与野生型着丝粒之间的竞争导致诱导物亲本的着丝粒失活，并因此导致单亲本染色体消除。结果，含有改变的CENH3蛋白的染色体在早期胚胎发育期间丧失，产生仅含有野生型亲本染色体的单倍体后代。[0004]因此，单倍体植物可以通过将作为单倍体诱导物的“GFP-尾部交换”转基因植物与野生型植物杂交而获得。然而，如上所述，这种技术需要大量改变CENH3蛋白质，且所述植物包含异源转基因，这样由于增加了关于基因工程化作物的公众阻碍而存在经济学问题。[0005]因此，本发明的一个目的是克服前述问题及特别提供了替代的单倍体诱导物植物，其不包含对其CENH3蛋白质的大量修饰和或不是基因工程化的。[0006]这个问题通过独立权利要求的主题得以解决，特别是由具有单倍体诱导物生物活性及包含编码具有CATD结构域的着丝粒组蛋白H3CENH3的核苷酸序列的植物而解决，其中所述核苷酸序列包含导致在CATD结构域中CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，所述改变赋予单倍体诱导物生物活性。CENH3蛋白质的CATD结构域对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38的位置113-155的氨基酸序列，和或CENH3蛋白质的CATD结构域由对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.37的位置337-465的核苷酸序列编码。拟南芥序列仅作为参考，并不将本发明限于具体的拟南芥序列。由于高水平的保守，本领域技术人员在任何其它植物材料或植物物种中能发现对应于拟南芥序列的核苷酸序列和氨基酸序列。在本发明中，术语“改变”是指对CENH3蛋白质的氨基酸序列的任何修饰包括多重修饰），这是由在编码着丝粒组蛋白H3CENH3的核苷酸序列中的至少一个突变所致。核苷酸序列可以是基因组DNA或者CENH3基因的cDNA。改变可以是取代一或多个氨基酸、插入一或多个氨基酸或者缺失一或多个氨基酸。能改变蛋白质CENH3的氨基酸序列的在DNA水平的突变可以是导致氨基酸取代或者终止密码子的点突变、移动了CENH3基因的读框的插入或缺失，或者是在剪接位点的突变。[0007]在一个优选的实施方案中，导致氨基酸取代的突变位于CATD结构域的环1内。环1对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38所示位置114-126的氨基酸序列，和或环1由对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.37的核苷酸位置340-378的核苷酸序列编码。所述拟南芥序列仅作为参考，不将本发明限于特异性的拟南芥序列。由于高水平的保守，本领域技术人员在任何其它植物材料或植物物种中能发现对应于拟南芥序列的核苷酸序列和氨基酸序列。[0008]在另一个优选的实施方案中，导致氨基酸取代的至少一个突变位于CATD结构域的α2螺旋内。α2_螺旋对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38所示位置127-155的氨基酸序列，和或α2-螺旋由对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.37所示核苷酸位置379-465的核苷酸序列编码。所述拟南芥序列仅作为参考，不将本发明限于特异性的拟南芥序列。由于高水平的保守，本领域技术人员在任何其它植物材料或植物物种中能发现对应于拟南芥序列的核苷酸序列和氨基酸序列。[0009]CENH3蛋白质是H3组蛋白的变体，其是活性着丝粒的着丝点复合物的成员，即在细胞分裂期间纺锤丝附着的染色体上的蛋白质结构。基本上，CENH3蛋白质特征在于不形成严格二级结构的可变的尾部结构域，及由三个α-螺旋区（称作α1_α3,通过两个环部分连接组成的保守的组蛋白折叠结构域。高度保守的CATD结构域CENP-A靶向结构域位于组蛋白折叠结构域内，其是由部分α1-螺旋、完整的α2-螺旋及连接环1组成。保守的CATD结构域为伴侣蛋白荷载CENH3所要求，因此对于其着丝点定位和着丝粒功能至关重要。[0010]本发明人令人惊奇地发现可以通过取代保守CATD结构域内、特别是CENH3蛋白质的环1或α2_螺旋中的一个单一氨基酸而获得具有产生单倍体后代能力即单倍体诱导物功能的植物。有利地，这可以通过转基因以及非转基因方法而实现。由于违反基因改造的生物体GMO的规定以及增加公众对于基因改造的生物体GMO或者通过GMO产生的植物特别是用于人类消费的作物的抗拒以及大量的市场授权过程包括这种GMO的严格安全性评价的巨额成本，优选非转基因方法。[0011]本发明提供包含且表达具有CATD结构域的CENH3蛋白质的植物，其中在CATD结构域中，特别是在环1或者α2-螺旋中，最优选在分别具有SEQIDNo.49或1的共有序列的环1或者α2_螺旋中，在所述植物的内源性编码的CENH3蛋白质中发生的氨基酸缺失或者由另一氨基酸取代。这种改变可赋予植物单倍体诱导物生物活性。[0012]在优选的实施方案中，部分涉及包含编码具有CATD结构域的着丝粒组蛋白Η3CENH3的核苷酸序列的植物，其中部分编码CATD结构域的核苷酸序列包含突变，及其中所述突变导致在环1中CENH3蛋白质的CATD结构域中氨基酸序列改变，其a由对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.37所示核苷酸位置340-378的核苷酸序列编码，其对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38的位置114-126的氨基酸序列，或者由对应于来源于甜菜Betavulgaris的SEQIDNo.60的核苷酸位置271-306的核苷酸序列编码，其对应于来源于甜菜的SEQIDNo.61的位置91-102的氨基酸序列，或者由对应于来源于甘蓝型油菜Brassicanapus的SEQIDNo.51的核苷酸位置346-384的核苷酸序列编码，其对应于来源于甘蓝型油菜的SEQIDNo.52的位置116-128的氨基酸序列，或者由对应于来源于玉米（Zeamays的SEQIDNo.57的核苷酸位置280-318的核苷酸序列编码，其对应于来源于玉米的SEQIDNo.58的位置94-106的氨基酸序列，或者由对应于来源于高粱（Sorghumbicolor的SEQIDNo.54的核苷酸位置280-318的核苷酸序列编码，其对应于来源于高粱的SEQIDNo.55的位置94-106的氨基酸序列，或者由对应于来源于大麦Hordeumvulgare的SEQIDNo.33KENH3的核苷酸位置208-264的核苷酸序列编码，其对应于来源于大麦的SEQIDNo.3403CENH3的位置70-88的氨基酸序列，或者具有SEQIDNo.49的共有序列，及b位于如上述CENH3蛋白质的CATD结构域内，或者所述突变导致α2-螺旋中CENH3蛋白质的CATD结构域中氨基酸序列改变，其a由对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.37的核苷酸位置379-465的核苷酸序列编码，其对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38的位置127-155的氨基酸序列，或者由对应于来源于甜菜的SEQIDNo.60的核苷酸位置307-393的核苷酸序列编码，其对应于来源于甜菜的SEQIDNo.61的位置103-131的氨基酸序列，或者由对应于来源于甘蓝型油菜的SEQIDNo.51的核苷酸位置385-471的核苷酸序列编码，其对应于来源于甘蓝型油菜的SEQIDNo.52的位置129-157的氨基酸序列，或者由对应于来源于玉米的SEQIDNo.57的核苷酸位置319-405的核苷酸序列编码，其对应于来源于玉米的SEQIDNo.58的位置107-135的氨基酸序列，或者由对应于来源于高粱的SEQIDNo.54的核苷酸位置319-405的核苷酸序列编码，其对应于来源于高粱的SEQIDNo.55的位置107-135的氨基酸序列，或者由对应于来源于大麦的SEQIDNo.3303CENH3的核苷酸位置265-351的核苷酸序列编码，其对应于来源于大麦的SEQIDNo.3403CENH3的位置89-117的氨基酸序列，或者具有SEQIDNo.1的共有序列，及b位于如上述CENH3蛋白质的CATD结构域内。因此，优选所述改变位于结构域的环1或α2_螺旋中。CATD结构域的非突变的环1在植物物种中是高度保守的，长度为13个氨基酸，从位置1开始至位置13结束。在本发明中，关于环1或者下述SEQIDNo.49的共有序列给出的任何氨基酸位置均是关于这个编号系统。优选地，非突变的环1呈现出表1中示出的氨基酸序列。[0013]表1:在CENH3蛋白质的环1中的确定的（specified氨基酸[0015]更优选地，环1具有SEQIDNo.49所示共有序列，其是：[0016]TNFLAPXEVTRffT[0017]51013[0018]如上所示，环1包含不确定的氨基酸（以X表示和确定的氨基酸[以单字母代码表示]。[0019]CATD结构域的非突变的α2-螺旋在植物物种中是高度保守的其长度为29个氨基酸，从位置1开始至位置29结束。在本发明中，关于α2-螺旋或下述SEQIDNo.1所示共有序列的氨基酸位置是关于这个编号系统。优选地，非突变的α2_螺旋呈现出如下表2所示氨基酸序列。[0020]表2:CATD结构域的α2-螺旋中的确定的氨基酸[0023]更优选地，α2_螺旋具有SEQIDNo.1所示共有序列，其是：[0025]如上所示，α2_螺旋包含确定的氨基酸（以单字母代码表示）。[0026]根据本发明的一个优选实施方案，导致CENH3蛋白质的CATD结构域中氨基酸序列改变的突变可以产生具有产生单倍体后代能力的想要的植物，所述突变是如在表2或SEQIDNo.1或者在表1或SEQIDNo.49中限定的任何不确定的氨基酸或者确定的氨基酸的突变，优选氨基酸的取代或缺失。[0027]如在表1或SEQIDNo.49中给出的不确定的氨基酸是这样的氨基酸，尽管其在一组特定植物物种、在特定植物属或者在一特定植物物种中是确定的，但是在更大范围的植物物种中不是保守的。因此，在一组特定的植物物种中、在特定的植物属中或者在一特定植物物种中，SEQIDNo.49所示或表1给出的不确定的氨基酸是明确限定的特定的氨基酸，然而在其它植物物种中相同位置可能未发现。因此，SEQIDNo.49或者如表1所示的不确定的氨基酸的氨基酸取代是指在植物中、即在特定植物物种中，特定的但非保守的氨基酸由另一氨基酸取代，所述另一氨基酸与在这组特定植物物种、在这个特定的植物属或者在这个特定的植物物种中在所述植物物种的内源性编码的天然CENH3蛋白质中在该位置天然存在氨基酸不同。此外，不确定的氨基酸以及确定的氨基酸可以是蛋白质折叠或蛋白质稳定性必需的氨基酸。这种氨基酸的改变可导致具有削弱的稳定性或不正确折叠的突变体CENH3产生。[0028]在表1和表2中示出的确定的氨基酸及SEQIDNo.49和1所示特定氨基酸是在广泛的植物物种中存在的那些氨基酸，优选如下文列出的那些，因此，其是非常保守的。[0029]在优选的实施方案中，SEQIDNo.49或1所示共有序列是来源于选自如下一组的物种的环1和α2-螺旋的序列编辑的：大麦、Hordeumbulbusom、高粱、甘庶（Saccharumofficinarium、玉米、小米（Setariaitalica、小粒野生稻Oryzaminuta、水稻Orizasativa、澳洲野生稻（Oryzaaustraliensis、野生稻（Oryzaalta、小麦（Triticumaestivum、黑麦（Secalecereale、苹果（Malusdomestica、二穆短柄草（Brachypodiumdistachyon、Hordeummarinum、山羊草（Aegilopstauschii、Daucusglochidiatus、甜菜、DaucuspusilIus、Daucusmuricatus、古月萝卜（Daucuscarota、巨桉（Eucalyptusgrandis、美花烟草（Nicotianasylvestris、绒毛烟草（Nicotianatomentosiformis、烟草（Nicotianatabacum、番前（SolanumIycopersicum、马铃薯（Solanumtuberosum、中果咖啡（Coffeacanephora、葡萄（Vitisvinifera^ErythranteguttataGenIiseaaurea、黄瓜（Cucumissativus、桑树（Morusnotabilis、Arabidopsisarenosa、深山南芥（Arabidopsislyrata、拟南芥、须弥芥（Crucihimalayahimalaica、卵叶须弥芥Crucihimalayawallichii、弯曲碎米养CardaminefIexuosa、北美独行菜（Lepidiumvirginicum、养菜（Capsellabursapastoris、01marabidopsispumila、硬毛南芥Arabishirsute、甘蓝型油菜、甘蓝Brassicaoeleracia、完菁Brassicarapa、萝卜Raphanussativus、芥菜（Brassicajuncea、黑芥菜（Brassicanigra、芝麻菜苜蓿亚种（Erucavesicariasubsp·Sativa、甜禮（Citrussinensis、麻风树（Jatrophacurcas、毛果杨（Populustrichocarpa、漠藜苜蓿（Medicagotruncatula、Ciceryamashitae、Cicerbijugum、鹰嘴豆（Cicerarietinum、野生鹰嘴豆（Cicerreticulatum、Cicerjudaicum、CajanuscajanifοIius、蔓草虫豆（Cajanusscarabaeoides、菜显（Phaseolusvulgaris、大显（Glycinemax、紫云英（Astragalussinicus、百脉根（Lotusjaponicas、夏堇（Toreniafournieri、洋葱（Alliumcepa、葱Alliumfistulosum、蒜Alliumsativum和韭菜Alliumtuberosum〇[0030]在特别优选的实施方案中，突变导致如表I或表2所示的确定的氨基酸的取代或缺失。因此，本发明的植物包含如表1或2所示的确定的氨基酸，即在表1或表2中保守及命名的那些氨基酸的至少一个取代或缺失。[0031]如表1中所示的确定的氨基酸的取代或缺失应是指选自如下组的氨基酸的取代或缺失：[0032]a在位置1的苏氨酸、丝氨酸或者丙氨酸，[0033]b在位置2的组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，[0034]c在位置3的甲硫氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、亮氨酸、组氨酸或甘氨酸，[0035]d在位置4的亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或酪氨酸，[0036]e在位置5的丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸，[0037]f在位置6的脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸或赖氨酸，[0038]g在位置8的谷氨酰胺、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬酰胺或丙氨酸，[0039]h在位置9的异亮氨酸、缬氨酸或脯氨酸，[0040]i在位置10的天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸或丝氨酸，[0041]j在位置11的精氨酸或脯氨酸，[0042]k在位置12的色氨酸或酪氨酸，及[0043]1在位置13的苏氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸。[0044]如表2中所示确定氨基酸的取代或缺失应是指选自如下组的氨基酸的取代或缺失：[0045]a在位置1的丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或亮氨酸，[0046]b在位置2的谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或亮氨酸，[0047]c在位置3的丙氨酸，[0048]d在位置4的亮氨酸或缬氨酸，[0049]e在位置5的缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、精氨酸、酪氨酸或苏氨酸，[0050]f在位置6的丝氨酸或丙氨酸，[0051]g在位置7的异亮氨酸或亮氨酸，[0052]h在位置8的谷氨酰胺，[0053]i在位置9的谷氨酸，[0054]j在位置10的丙氨酸或丝氨酸，[0055]k在位置11的丙氨酸或苏氨酸，[0056]1在位置12的谷氨酸，[0057]m在位置13的天冬氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸或酪氨酸，[0058]η在位置14的酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸，[0059]〇在位置15的亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，[0060]Ρ在位置16的缬氨酸或异亮氨酸，[0061]q在位置17的甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺，[0062]r在位置18的亮氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸，[0063]s在位置19的苯丙氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，[0064]t在位置20的丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸，[0065]u在位置21的天冬氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸，[0066]V在位置22的丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸或苏氨酸，[0067]w在位置23的甲硫氨酸、色氨酸、天冬酰胺或组氨酸，[0068]X在位置24的亮氨酸或组氨酸，[0069]y在位置25的半胱氨酸或亮氨酸，[0070]Z在位置26的丙氨酸或苏氨酸，[0071]aa在位置27的亮氨酸或异亮氨酸，[0072]bb在位置28的组氨酸，及[0073]cc在位置29的丙氨酸或丝氨酸。[0074]在一特别优选的实施方案中，至少一个突变导致SEQIDNo.49的确定的氨基酸的取代或缺失。因此，本发明的植物包含SEQIDNo.49的确定的氨基酸，即在SEQIDNo.49的共有序列中高度保守及命名的那些氨基酸的至少一个取代或缺失。SEQIDNo.49的确定的氨基酸的取代或缺失应是指选自如下组的氨基酸的取代或缺失：[0075]a在位置1的苏氨酸，[0076]b在位置2的天冬酰胺，[0077]c在位置3的苯丙氨酸，[0078]d在位置4的亮氨酸，[0079]e在位置5的丙氨酸，[0080]f在位置6的脯氨酸，[0081]g在位置8的谷氨酸，[0082]h在位置9的缬氨酸，[0083]i在位置10的苏氨酸，[0084]j在位置11的精氨酸，[0085]k在位置12的色氨酸，及[0086]1在位置13的苏氨酸。[0087]在一特别优选的实施方案中，突变导致SEQIDNo.1的确定的氨基酸的取代或缺失。因此，本发明的植物包含SEQIDNo.1的确定的氨基酸，即在SEQIDNo.1的共有序列中高度保守及命名的那些氨基酸的至少一个取代或缺失。SEQIDNo.1的确定的氨基酸的取代或缺失应是指选自如下组的氨基酸的取代或缺失：[0088]a在位置1的丙氨酸，[0089]b在位置2的谷氨酸，[0090]c在位置3的丙氨酸，[0091]d在位置4的亮氨酸，[0092]e在位置5的亮氨酸，[0093]f在位置6的丙氨酸，[0094]g在位置7的亮氨酸，[0095]h在位置8的谷氨酰胺，[0096]i在位置9的谷氨酸，[0097]j在位置10的丙氨酸，[0098]k在位置11的丙氨酸，[0099]1在位置12的谷氨酸，[0100]m在位置13的天冬氨酸，[0101]η在位置14的苯丙氨酸，[0102]ο在位置15的亮氨酸，[0103]ρ在位置16的缬氨酸，[0104]q在位置17的组氨酸，[0105]r在位置18的亮氨酸，[0106]s在位置19的苯丙氨酸，[0107]t在位置20的谷氨酸，[0108]u在位置21的天冬氨酸，[0109]V在位置22的丙氨酸，[0110]w在位置23的甲硫氨酸，[0111]X在位置24的亮氨酸，[0112]y在位置25的半胱氨酸，[0113]z在位置26的丙氨酸，[0114]aa在位置27的异亮氨酸，[0115]bb在位置28的组氨酸，及[0116]cc在位置29的丙氨酸。[0117]在进一步特别优选的实施方案中，突变导致环1中确定的氨基酸的取代或缺失，其中在SEQIDNo.49的位置2的氨基酸天冬酰胺被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.55的位置95的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.49的位置6的氨基酸脯氨酸被取代，优选取代为丝氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置121的氨基酸脯氨酸被取代，优选取代为丝氨酸，或者在SEQIDNo.49的位置12的氨基酸色氨酸被取代，优选取代为终止信号，或者在SEQIDNo.52的位置127的氨基酸色氨酸被取代，优选取代为终止信号。[0118]在进一步特别优选的实施方案中，突变导致在α2_螺旋中确定的氨基酸的取代或缺失，其中在SEQIDNo.1的位置1的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.58的位置107的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置4的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，或者在SEQIDNo.52的位置132或者在SEQIDNo.34的位置92或者在SEQIDNo.38的位置130或者在SEQIDNo.61的位置106的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，或者在SEQIDNo.1的位置7的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为脯氨酸，或者在SEQIDNo.61的位置109的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为脯氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置8的氨基酸谷氨酰胺被取代，优选取代为终止信号或亮氨酸，或者在SEQIDNo.58的位置114或者在SEQIDNo.61的位置110的氨基酸谷氨酰胺被取代，优选取代为终止信号或亮氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置10的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置138的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置25的氨基酸半胱氨酸被取代，优选取代为酪氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置153的氨基酸半胱氨酸被取代，优选取代为酪氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置26的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置154的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸。[0119]在本发明中，术语“突变”是指至少一个突变，优选一个突变，特别是唯一一个突变。在进一步优选的实施方案中，术语“至少一个突变”是指两个突变，特别是仅两个突变。在进一步优选的实施方案中，术语“至少一个突变”是指三个突变，特别是仅三个突变。在进一步优选的实施方案中，术语“至少一个突变”是指四个突变，特别是仅四个突变。在进一步优选的实施方案中，术语“至少一个突变”是指五个突变，特别是仅五个突变。在超过一个突变的情况中，突变也可以发生在不同的多核苷酸中，导致不同CENH3蛋白质（如果对于特定的植物物种存在的话的CATD结构域中氨基酸序列改变。例如，大麦具有两个不同的CENH3蛋白质。[0120]在本发明的一个优选实施方案中，突变是至少一个突变、至少两个突变、至少三个突变、至少四个突变，或者至少五个突变。[0121]在本发明的一个优选实施方案中，最大突变数是2、3、4、5、6、7、8、9个，最优选10个。[0122]在进一步优选的实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2_螺旋中，存在一个氨基酸取代，特别是仅一个氨基酸取代。[0123]在进一步优选的实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2_螺旋中，存在两个氨基酸取代，特别是仅两个氨基酸取代。[0124]在进一步优选的实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2_螺旋中，存在三个氨基酸取代，特别是仅三个氨基酸取代。[0125]在进一步优选的实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2_螺旋中，存在四个氨基酸取代，特别是仅四个氨基酸取代。[0126]在进一步优选的实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2_螺旋中，存在五个氨基酸取代，特别是仅五个氨基酸取代。[0127]在本发明的一个优选实施方案中，在CATD结构域中、优选在CATD结构域的环1或α2-螺旋中，存在1、1或2、1-3、1-4、1-5、优选1-6及更优选1-7个氨基酸取代。[0128]特别地，本发明涉及在CENH3蛋白质内、特别是在其CATD结构域中导致或引起氨基酸取代的突变。因此，在本发明中，突变优选是在编码CENH3蛋白质的DNA序列中的非同义点突变或者取代，导致氨基酸改变。这也称作错义突变。进一步地，氨基酸改变或者氨基酸取代可以是保守的，即改变为具有相似物理化学性质的氨基酸;半保守的，例如负电荷氨基酸改变为正电荷氨基酸;或者是彻底改变，即改变为极为不同的氨基酸。[0129]在本发明的一个优选实施方案中，具有单倍体诱导物生物活性的本发明的植物关于所述突变或者至少一个突变是纯合的。在本发明的进一步的实施方案中，具有单倍体诱导物生物活性的本发明的植物关于所述突变或者至少一个突变是杂合的。[0130]本发明的植物具有单倍体诱导物生物活性。这是指在本发明的植物与野生型植物或表达野生型CENH3蛋白质的植物之间杂交时产生至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、优选至少1%、优选至少2%、优选至少3%、优选至少4%、优选至少5%、优选至少6%、优选至少7%、优选至少8%、优选至少9%、最优选至少10%、至少15%、至少20%或更多的单倍体后代。因此，野生型植物优选是相同物种的植物，其不包含根据本发明的植物在相应内源性CENH3基因内的突变，即植物能表达天然CENH3蛋白质，及表达野生型CENH3的植物优选是相同物种的植物，其包含i无根据本发明的植物的突变的编码CENH3蛋白质的核苷酸序列，并能表达所述天然CENH3蛋白质，或者ii编码来自另一植物物种的CENH3蛋白质的核苷酸序列，其示出与天然CENH3相当的功能性，例如来源于另一植物物种的这种CENH3蛋白质可以作为转基因导入。[0131]因此，本发明最有利地提供了在广泛的真双子叶植物eudicot、双子叶植物和单子叶植物物种中产生单倍体诱导物株系的手段和方法。本发明还可以交换母本细胞质及在一个程序步骤中产生例如具有想要的基因型的细胞质雄性不育植物。在单一氨基酸突变可以通过诱变或任何其它非基于GMO的方法产生的范围内，本发明是有利的。[0132]因此，在优选的实施方案中，通过应用单倍体诱导物株系单倍体化的完整程序的特征在于在至少一个位置具有本发明提供的改变的点突变的编码CENH3蛋白质的内源CENH3基因是非转基因的。[0133]在本发明中，“内源”基因、等位基因或蛋白质是指植物的非重组序列，其与在各自的植物、特别是野生型植物中存在的序列相同。术语“突变的”是指人为改变的序列。举例的人为诱导的非转基因突变包括将植物暴露于高剂量化学、放射性或者其它诱变剂以选择突变体。或者，人为诱导的转基因突变，即重组改变或基因工程，例如利用TALE核酸酶、锌指核酸酶或者CRISPRCas系统进行，包括DNA或氨基酸序列的融合、插入、缺失和或改变。[0134]多核苷酸或多肽序列对于某生物体而言，如果其源自外来物种或者源自相同物种但是从其原来形式加以修饰，则其与所述生物体是“异源或外源的”。“重组”是指人为改变的，即转基因的多核苷酸或多肽序列。所用术语“转基因”为在本领域理解且是指通过对细胞基因组进行人为分子操纵如通过分子转化而将优选异源的）核酸导入细胞中。因此，“转基因植物”是包含转基因的植物，即是经遗传修饰的植物。转基因植物可以是其中导入转基因的起始植物，其后代的基因组含有转基因。[0135]术语“编码…的核苷酸序列”是指指导特定蛋白质，特别是CENH3蛋白质或其部分的表达的核酸。核苷酸序列包括被转录为RNA的DNA链序列及被翻译为蛋白质的RNA序列。核苷酸序列包括全长核酸序列以及衍生自全长序列的非全长序列。[0136]术语“基因”是指编码核苷酸序列和相关的调节核苷酸序列、内含子、5’UTR和或3,UTR0[0137]术语“调节元件”是指位于核苷酸序列，优选编码序列（其转录和表达由调节元件控制，潜在地与细胞的蛋白质生物合成装置结合）的上游（5’）、核苷酸序列内和或下游3’）的序列，优选核苷酸序列。“调节”是指通过主要位于但不只是位于感兴趣的基因的转录起始处上游（5’）的DNA序列元件诱导的基因表达的调节。调节可导致对于刺激全部应答或者无应答，或者其可以导致基因表达水平的变化。[0138]如果两个序列的位置和朝向使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达，则调节元件，特别是DNA序列如启动子被称作“可操纵地连接于”编码RNA或蛋白质的DNA序列或者与其“关耳关”。[0139]“启动子”是起始相关的DNA序列转录的DNA序列，特别是位于转录起始处上游5’）及参与识别RNA聚合酶。根据特异性启动子区域，其也可以包含作为基因表达调节物的元件，如激活子、增强子和或阻抑子。[0140]“3’调节元件”（或者3’末端）是指确定正确的终止位点及含有聚腺苷酸化信号及能实现信使RNAmRNA加工或基因表达的任何其它调节信号基因部分，包含除了驱动转录起始的5’序列之外的DNA区段和基因的结构部分。聚腺苷酸化信号通常特征在于实现在mRNA前体的3’末端加入聚腺苷酸。通常通过存在与规范化形式5’-AATAAA-3’同源识别聚腺苷酸化信号。[0141]术语“编码序列”是指编码蛋白质、多肽或其部分的基因部分，不包括驱动转录起始或终止的调节序列。[0142]基因、编码序列或者调节元件可以是在细胞中正常发现的，在这种情况中称作“自体的”或者“内源的”，或者其可以是在细胞定位中不是正常发现的在这种情况中称作“异源的”、“转基因的”或者“转基因”。[0143]“异源”基因、编码序列或者调节元件也可以细胞自体的，但是排列顺序和或方向或者在基因组中位置或环境在其转移进的细胞中不是正常发现或者发生的。[0144]术语“载体”是指重组DNA构建体，其可以是质粒、病毒、自主复制序列、人工染色体，如细菌人工染色体BAC、噬菌体或其它核苷酸序列，其中已经结合或重组了至少两个核苷酸序列，其中至少一个序列是本发明的核酸分子。载体可以是线性或环形的。载体可以由单链或双链DNA或RNA组成。[0145]术语“表达”是指内源基因或转基因在植物中转录和或翻译。[0M6]“转化”和“转移”是指将核酸分子，特别是DNA转移进细胞中的方法，包括但不限于基因枪方法如粒子轰击、显微注射、用各种物理方法例如电穿孔或者化学处理方法如聚乙二醇或PEG透过细胞膜;原生质体融合或者根癌农杆菌或发根农杆菌介导的转化。对于在植物细胞中注射或电穿孔DNA，对于使用的质粒没有特殊要求。可以使用质粒如pUC衍生物。如果从这种转化的细胞中再生完整植物，优选使用可选择标记。根据将想要的基因导入植物细胞中的方法，也许需要其它的DNA序列；如果例如Ti或Ri质粒用于植物细胞的转化，Ti和Ri质粒T-DNA的至少右侧边界、通常是右侧和左侧边界作为侧翼区与导入的基因连接。优选地，转移的核酸分子稳定地整合在受体植物的基因组或质体基因组中。[0147]在本发明中，术语“单倍体诱导物生物活性”或者“单倍体诱导物”或者“单倍体诱导物株系”是指在与野生型植物或者至少表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交时，在至少0.1%、至少0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、优选至少1%、优选至少2%、优选至少3%、优选至少4%、优选至少5%、优选至少6%、优选至少7%、优选至少8%、优选至少9%、最优选至少10%、最优选至少15%、最优选至少20%的情况中具有产生单倍体后代或子代能力的植物或植物株系。由于单倍体诱导物的染色体在减数分裂期间被消除，因此所得单倍体后代仅包含野生型亲本的染色体。然而，在单倍体诱导物是杂交的胚珠亲本的情况中，单倍体后代具有诱导物的细胞质及野生型亲本的染色体。[0148]根据本发明，术语“植物”包括完整植物或者完整植物的部分。[0149]完整植物优选是种子植物或者农作物。植物的部分是例如芽营养器官结构，如叶、茎干和块茎;根，花和花器官floralorgan结构，例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠;种子，包括胚、胚乳和种皮;果实和成熟子房;植物组织，例如维管组织、基本组织等;及细胞，如保卫细胞、卵细胞、毛状体等；以及其后代。[0150]在任何情况中，本发明的植物包含至少一种细胞，所述细胞包含编码包含CATD结构域的着丝粒组蛋白H3蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在CATD结构域中导致CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，所述改变可以赋予植物单倍体诱导物的生物活性，优选如在本文中更详细描述的。最优选地，本发明植物的大多数或者特别是所有细胞均包含如本文所述突变。[0151]可用于本发明方法中的植物的物种优选是真双子叶植物、双子叶植物和单子叶植物。[0152]在优选的实施方案中，术语“植物”只是涉及完整植物，即呈现出成熟植物的全部表型且能再生的植物、其发育早期阶段，例如植物胚，或者是指这二者。[0153]在本发明的实施方案中，术语“植物”是指完整植物的一部分，特别是植物材料、植物细胞或植物细胞培养物。[0154]术语“植物细胞”描述了植物的结构和生理学单位，其包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞形式，如气孔保卫细胞或者培养的细胞，或者作为更高等组织单位higherorganizedunit，例如植物组织或植物器官的部分。[0155]术语“植物材料”包括植物的部分，特别是植物细胞、植物组织，特别是植物繁殖材料，优选叶、莖、根、萌发的（emerged胚根、花或花的部分、花瓣、果实、花粉、花粉管、花药、花丝、胚珠、胚囊、卵细胞、子房、受精卵、胚、合子胚、体细胞胚、下胚轴切片、顶端分生组织、维管束、中柱鞘、种子、根、插枝、细胞或组织培养物，或者植物的任何其它部分或产物。[0156]因此，本发明还提供了本发明植物的植物繁殖材料。所述“植物繁殖材料”应理解为是可以在体内或体外有性或无性繁殖的任何植物材料。在本发明范围内特别优选原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚、花粉、卵细胞、受精卵，以及得自转基因植物的任何其它繁殖材料。通过本发明的方法起源于突变的植物的植物部分如花、茎、果实、根或者先前突变、优选转化的及因此包含至少部分突变的细胞的其后代，也是本发明的一方面。[0157]优选地，本发明的植物选自如下一组:大麦大麦）、高粱高粱）、黑麦黑麦）、小黑麦、甘蔗（甘蔗）、玉米玉米）、谷子小米）、水稻水稻）、小粒野生稻、澳洲野生稻、野生稻、小麦小麦）、硬粒小麦Triticumdurum、Hordeumbulbosum、紫色假雀麦二穗短柄草）、海大麦（Hordeummarinum、山羊草（山羊草）、苹果（苹果）、甜菜、向日葵（向日葵Helianthusannuus、澳大利亚胡萝卜（Daucusglochidiatus、美国野胡萝卜（Daucuspusillus、Daucusmuricatus、胡萝卜（胡萝卜）、桉树（巨桉）、Erythrantheguttata、Genliseaaurea、林地烟草美花烟草）、烟草烟草）、绒毛烟草、番茄番茄）、马铃薯（马铃薯）、咖啡（中果咖啡）、葡萄（葡萄）、黄瓜黄瓜）、桑树桑树）、拟南芥thalecress拟南芥）、深山南芥、沙石水序（sandrock-cressArabidopsisarenosa、须弥芥、卵叶须弥芥、波状野荠菜（弯曲碎米荠）、胡椒草（北美独行菜）、荠菜（荠菜）、01marabid〇pSiSpumila、毛状石水序hairyrockcress硬毛南芥）、油菜甘蓝型油菜）、花椰菜甘蓝）、宪菁、Brassicajuncacea、黑芥黑芥菜）、萝卜萝卜）、芝麻菜苜蓿、橙甜橙）、麻风树、大豆、以及黑三角叶杨毛果杨）。[0158]特别优选所述植物选自如下一组:大麦大麦）、高粱高粱）、黑麦黑麦）、小黑麦、甘鹿（甘鹿）、玉米（玉米）、水稻（水稻）、小麦（小麦）、硬粒小麦、燕麦（Avenasativa、Hordeumbulbosum、甜菜、向日葵（向日葵）、胡萝卜（胡萝卜）、烟草烟草）、番前番前）、马铃薯（马铃薯）、咖啡（中果咖啡）、葡萄（葡萄）、黄瓜黄瓜）、拟南芥拟南芥）、油菜甘蓝型油菜）、花椰菜甘蓝）、宪菁、Brassicajuncacea、黑芥黑芥菜）、萝卜萝卜和大豆。[0159]在优选的实施方案中，本发明的植物含有作为内源基因或者转基因的的编码CENH3的核苷酸序列。[0160]在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明教导的植物，其中在编码CENH3的核苷酸序列中经非转基因或转基因地导入所述改变。[0161]因此，优选在实施方案中，其中所述突变是在内源CENH3基因中产生，获得的植物是非转基因的。优选地，所述突变是通过非转基因诱变、特别是化学诱变实现的，优选通过EMS甲基磺酸乙酯诱导的TILLING或者靶向基因组编辑方法实现。[0162]因此，本发明涉及一种植物，其中非转基因导入突变是通过化学诱变、特别是通过TILLING实现的，所述突变在CATD结构域中导致CENH3蛋白质的氨基酸序列改变，优选氨基酸取代或缺失，及所述改变赋予植物单倍体诱导物生物活性。[0163]在另一个优选的实施方案中，所述突变以转基因形式导入植物中。优选地，这是通过转化包含编码包含改变的CENH3的至少CATD结构域的核苷酸序列的载体实现的，优选如本文所述。转化植物及将转基因导入植物基因组中的方法为本领域熟知。[0164]因此，在优选的实施方案中提供了一种植物，其中在CENH3蛋白质内经转基因导入改变，优选氨基酸取代或氨基酸缺失是通过载体转化实现的，所述载体包含这样的核苷酸序列，其编码位于CATD结构域中至少环1及对应于来源于拟南芥的SEQIDNo.38所示CENH3蛋白质的位置340-378的核苷酸，但是包含SEQIDNo.49所示共有序列或者表1所示的确定的氨基酸的至少一个氨基酸取代或缺失，或者编码位于CATD结构域中的至少α2-螺旋及对应于衍生自拟南芥的SEQIDNo.38所示CENH3蛋白质的位置379-465的核苷酸，但是包含SEQIDNo.1所示共有序列或表2所示的确定的氨基酸的至少一个氨基酸取代。在另一个实施方案中提供了一种植物，其中在CENH3蛋白质内导入氨基酸取代或缺失是通过载体转化实现的，所述载体包含这样的核苷酸序列，其编码至少CATD结构域或者包含CATD结构域的CENH3蛋白质，包含在SEQIDNo.49或1所示共有序列或表1或2所示的确定的氨基酸的至少一个氨基酸取代或缺失。[0165]优选地，农杆菌介导的转化、蘸花法或者粒子轰击法用于进行转化。[0166]在优选的实施方案中，其中编码根据本发明的突变的CENH3蛋白质的核苷酸序列以转基因形式被转化进植物中，及内源基因的一或两个等位基因优选被失活或敲除。在另一优选的实施方案中，其中编码根据本发明的突变的CENH3蛋白质的核苷酸序列以转基因形式被转化进植物中，所述转基因是过表达的，以作为更有竞争力的内源CENH3蛋白质优选在着丝点复合物产生期间更有竞争力。[0167]本发明还提供了通过本发明的方法可获得、特别是获得的植物，其特征在于具有单倍体诱导物生物活性。[0168]在本发明的优选实施方案中，产生根据本发明的具有单倍体诱导物生物活性的植物的方法本质上不是生物学方法。[0169]进一步地，本发明还提供了产生根据本发明的具有单倍体生物活性的植物的方法，包括如下步骤：[0170]i将植物的种子暴露于足量的诱变剂甲基磺酸乙酯EMS以获得Ml植物，[0171]ii使得可育的M2植物足量产生，[0172]iii分离M2植物的基因组DNA，及[0173]iv选择具有导致CENH3的CATD结构域中氨基酸序列改变的突变的个体。[0174]在优选的实施方案中，本发明进一步涉及一种产生根据本发明的具有单倍体诱导物生物活性的植物的方法，包括如下步骤：[0175]XX提供包含编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域的核苷酸序列的载体，其包含导致在CATD结构域中CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，[0176]yy用所述载体转化植物细胞，其中优选包含CENH3基因的一或两个内源等位基因失活或敲除的植物细胞，及[0177]zz从所述植物细胞再生具有单倍体诱导物生物活性的植物。[0178]在优选的实施方案中，本发明进一步涉及一种产生根据本发明的具有单倍体诱导物生物活性的植物的方法，包括如下步骤：[0179]yy用编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域的核苷酸序列转化植物细胞，其包含导致在CATD结构域中CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，或者用包含编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域的核苷酸序列的载体转化植物细胞，所述核苷酸序列包含导致在CATD结构域中CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，及[0180]zz从所述植物细胞中再生具有单倍体诱导物生物活性的植物。[0181]特别地，本发明涉及通过如下方法可获得、特别是获得的单倍体植物：[0182]a将根据本发明的具有单倍体诱导物生物活性的植物与表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，任选地，[0183]b鉴别从所述杂交步骤中产生的单倍体后代。[0184]优选地，鉴别的单倍体植物可以转变为双单倍体植物，优选通过秋水仙素处理转变，这也是本发明的一部分。因此，本发明还涉及将根据本发明的单倍体植物转变为双单倍体植物可获得、特别是获得的双单倍体植物，优选通过秋水仙素处理或者通过染色体自然加倍方法转变。[0185]因此，本发明还提供了一种产生单倍体植物的方法，包括如下步骤：[0186]a将根据本发明的具有单倍体诱导物生物活性的植物与表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，及[0187]b鉴别从所述杂交步骤中产生的单倍体后代。[0188]在进一步的步骤c中，将所选择的单倍体植物转变为双单倍体植物，优选通过秋水仙素处理转变。因此，本发明还涉及一种产生双单倍体植物的方法。[0189]在本发明的优选实施方案中，本发明提供的方法本质上不是生物学方法。[0190]特别地，本发明方法不是仅依赖于自然现象如杂交或选择，特别是不是由自然现象如杂交或选择组成，事实上是基本基于这样的技术教导以提供通过人为制备的特异性突变的核苷酸序列。因此，本发明在本发明的核苷酸序列和植物中导入称作突变的一种特定结构特征，该突变不是由于任何自然现象如杂交或选择导致或与其相关。[0191]在本发明的具体实施方案中，提供了一种包括杂交步骤的方法，所述杂交步骤不提供-如通常的杂交提供的-杂合后代，事实上提供纯合后代。进一步地，后代的单倍性不是用于有性杂交的植物的的基因混合所致。此外，在自然界找不到本发明权利要求的产生双单倍体植物的方法。[0192]进一步地，本发明还提供了一种促进细胞质交换的方法，包括如下步骤：[0193]X将本发明的植物作为胚珠亲本与作为花粉亲本的表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，及[0194]y获得包含花粉亲本染色体和胚珠亲本细胞质的单倍体后代。[0195]在本发明的优选实施方案中，本发明提供的方法本质上不是生物学方法。所述方法由于上述相同原因而本质上不是生物学方法，特别是由于其不是由自然现象如杂交和选择完全组成，而是包含一种显著的技术教导的基本特征，由此提供在本发明的核苷酸序列和植物中特定的突变。此外，后代的单倍性不是用于有性杂交的植物基因混合所致。[0196]所述方法可有利地用于产生细胞质雄性不育（CMSXMS是由于细胞核外基因组线粒体或叶绿体导致，并示出母系遗传性。因此，本发明的植物呈现出CMS，且是杂交的胚珠亲本。以此方式，CMS可以导入杂交配体中，优选是作物精英株系。[0197]在优选的实施方案中，本发明的植物可以用于恢复雄性生育力的方法，为CMS的杂交亲本提供正常的细胞质。通过这种杂交，CMS亲本的染色体导入非CMS的本发明单倍体诱导物的正常细胞质中。然而，CMS植物的花粉产生需要通过温度、光照、日照长度等诱导。[0198]不受理论限制，在图中示出了本发明的方法、特别是单亲染色体消除方法怎样在诱导物CENH3x野生型CENH3种间杂交胚中工作的模型。㈧可能单倍体诱导物来源的卵细胞含有较少的CENH3或者与野生型相比降低的未知“CENH3-跨世代需要的特征transgenerationrequiredsignature”。母本CENH3的量减少不太可能，因为根据使用CENH3-GFP报告蛋白在拟南芥植物中进行的研究，由CENH3标记的是精子核而不是卵细胞。然而，仍可能的是产生“着丝粒印迹”的剩余的母本CENH3传递至后代。⑶在受精后几小时内，将父本野生型CENH3从受精卵核中主动除去，及C在拟南芥中在胚乳发育的16核阶段发生合子中的CENH3-GFP的着丝粒再荷载。（D在经历单倍体化的胚中，母本染色体的着丝粒再荷载被削弱或延迟，由于在细胞分裂后期期间着丝粒失活导致滞后的染色体。随后，微核化的单倍体诱导物染色体降解及E单倍体胚产生。单倍体胚在母本细胞质背景中含有得自父本的染色体。[0199]本发明还涉及编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域或者包括结构域的蛋白质的核苷酸序列或者包括包含导致CATD结构域中CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变的CATD结构域的CENH3蛋白质。[0200]本发明还涉及包含所述核苷酸序列及如果存在的话优选如本文所示结合序列的载体特别是病毒载体、构建体或质粒载体。[0201]在本发明特别优选的实施方案中，编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域的核苷酸序列包含至少CENH3的完整编码区，特别是CENH3的基因。[0202]在本发明进一步优选的实施方案中，CENH3的编码序列可以与调节元件如5’和或3’调节元件结合，最优选与启动子、优选组成型或可诱导启动子结合。[0203]此外，本发明提供了包含所述核苷酸序列的植物细胞或包含所述核苷酸序列作为转基因的载体。[0204]在本发明中，如本文所用术语“包含”是指具有“包括”或“含有”的含义，是指除了明确提及的要素之外也可能存在其它要素。[0205]在本发明的优选实施方案中，如本文所用术语“包含”也应理解为是指“由…组成”，从而不包括除了明确提及的要素之外的其它要素。[0206]在进一步优选的实施方案中，如本文所用术语“包含”也应理解为是指“基本由…组成”，从而不包括除了明确提及的要素之外显著有助于公开的教导的其它要素。[0207]本发明进一步优选的实施方案是在权利要求书中的主题。[0208]本发明通过如下非限制性实施例和两个图表得以更详细阐述。[0209]序列方案示出：[0210]SEQIDNo.l:CENH3a2-螺旋的共有氨基酸序列，[0211]SEQIDNo.2-32:用于本发明中的引物的核苷酸序列，[0212]SEQIDNo.33:大麦的野生型f3-CENH3蛋白质的cDNA核苷酸序列，[0213]SEQIDNo.34:大麦的β-CENH3的氨基酸序列，[0214]SEQIDNo·35:大麦TILLING株系4528突变体）的β-CENH3的cDNA序列，[0215]SEQIDNo.36:大麦TILLING株系4528突变体）的0-CENH3的氨基酸序列，[0216]SEQIDNo.37:拟南芥CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0217]SEQIDNo.38:野生型拟南芥CENH3氨基酸序列，[0218]SEQIDN0.39:突变的拟南芥CENH3突变体L-I的编码序列（CDNA的核苷酸序列，[0219]SEQIDNO.40:突变的拟南芥CENH3突变体L-I的氨基酸序列，[0220]SEQIDNo.41:突变的拟南芥CENH3突变体L-F的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0221]SEQIDN0.42:突变的拟南芥CENH3突变体L-F的氨基酸序列，[0222]SEQIDNo.43:甜菜CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0223]SEQIDNo.44:野生型甜菜CENH3的氨基酸序列，[0224]SEQIDN0.45:甜菜CENH3突变体L-F的编码序列的核苷酸序列，[0225]SEQIDN0.46:突变的甜菜CENH3突变体L-F的氨基酸序列，[0226]SEQIDNo.47:甜菜CENH3突变体L-I的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0227]SEQIDN0.48:突变的甜菜CENH3突变体L-I的氨基酸序列，[0228]SEQIDNo.49:CENH3环1的共有氨基酸序列，[0229]SEQIDNo.50:甘蓝型油菜CENH3的野生型基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0230]SEQIDNo.51:甘蓝型油菜CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0231]SEQIDNo.52:野生型甘蓝型油菜CENH3的氨基酸序列，[0232]SEQIDNo.53:高粱CENH3的野生型基因组序列基因组DNA的核苷酸序列，[0233]SEQIDNo.54:高粱CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0234]SEQIDNo.55:野生型高粱CENH3的氨基酸序列，[0235]SEQIDNo.56:玉米CENH3的野生型基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0236]SEQIDNo.57:玉米CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0237]SEQIDNo.58:野生型玉米CENH3的氨基酸序列，[0238]SEQIDNo.59:甜菜CENH3野生型基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0239]SEQIDNo.60:甜菜CENH3的野生型编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0240]SEQIDNo.61:野生型甜菜CENH3的氨基酸序列，[0241]SEQIDNo.62:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体P121S的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0242]SEQIDNo.63:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体P121S的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0243]SEQIDNo.64:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体P121S的氨基酸序列，[0244]SEQIDNo.65:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体W127stop的基因组序列基因组DNA的核苷酸序列，[0245]SEQIDNo·66:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体W127stop的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0246]SEQIDNo·67:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体W127stop的氨基酸序列，[0247]SEQIDNo.68:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体L132F的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0248]SEQIDNo.69:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体L132F的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0249]SEQIDNo.70:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体L132F的氨基酸序列，[0250]SEQIDNo.71:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A138T的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0251]SEQIDNo.72:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A138T的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0252]SEQIDNo.73:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A138T的氨基酸序列，[0253]SEQIDNo.74:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体C153Y的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0254]SEQIDNo.75:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体C153Y的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0255]SEQIDNo.76:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体C153Y的氨基酸序列，[0256]SEQIDNo.77:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A154V的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0257]SEQIDNo.78:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A154V的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0258]SEQIDNo.79:突变的甘蓝型油菜CENH3突变体A154V的氨基酸序列，[0259]SEQIDNo.80:突变的玉米CENH3突变体A107T的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0260]SEQIDNo.81:突变的玉米CENH3突变体A107T的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0261]SEQIDNo.82:突变的玉米CENH3突变体A107T的氨基酸序列，[0262]SEQIDNo.83:突变的玉米CENH3突变体QlHstop的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0263]SEQIDNo.84:突变的玉米CENH3突变体QlHstop的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0264]SEQIDNo.85:突变的玉米CENH3突变体QlHstop的氨基酸序列，[0265]SEQIDNo.86:突变的高粱CENH3突变体A95V的基因组序列（基因组DNA的核苷序列，[0266]SEQIDNo.87:突变的高粱CENH3突变体A95V的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0267]SEQIDNo.88:突变的高粱CENH3突变体A95V的氨基酸序列，[0268]SEQIDNo.89:突变的甜菜CENH3突变体L106Q的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0269]SEQIDNo.90:突变的甜菜CENH3突变体L106Q的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0270]SEQIDNo.91:突变的甜菜CENH3突变体L106Q的氨基酸序列，[0271]SEQIDNo.92:突变的甜菜CENH3突变体L109P的基因组序列的核苷酸序列，[0272]SEQIDNo.93:突变的甜菜CENH3突变体L109P的编码序列（cDNA的核苷酸序列，[0273]SEQIDNo.94:突变的甜菜CENH3突变体L109P的氨基酸序列，[0274]SEQIDNo.95:突变的甜菜CENH3突变体Q110L的基因组序列（基因组DNA的核苷酸序列，[0275]SEQIDNo.96:突变的甜菜CENH3突变体Ql10L的编码序列（cDNA的核苷酸序列，及[0276]SEQIDNO.97:突变的甜菜CENH3突变体Q110L的氨基酸序列。[0277]图1示出关于本发明方法的机理模型。[0278]图2示出拟南芥第一行）、甜菜第二行）、甘蓝型油菜第三行）、玉米第四行）、高粱第五行的氨基酸序列的比对以及示出这五个植物物种的保守水平的图表。实施例[0279]实施例1:通过靶向基因组中局部损伤TILLING诱变大麦α和I3CENH3[0280]为了鉴别内源CENH3的单一点突变是否可以产生单倍体诱导物，筛选二倍体大麦Hordeumvulgare的EMS诱导的TILLING种群（Gottwaldetal.,22009,BMCResNotes，258，这是编码两个CENH3的有功能的变体α和0CENH3的物种（Saneietal.，1082011，ProcNatlAcadSciUSA，E498-505。假设任一CENH3变体互补，aCENH3或βCENH3的功能性突变仍可以产生子代。[0281]为此，筛选cv.Barke的10,279株经EMS处理的二倍体大麦Hordeumvulgare植物的TILLING种群以鉴别α和0CENH3突变体等位基因。用如下四个和三个引物组合分别扩增α和0CENH3变体的所有外显子及部分相应内含子，使用如先前描述的异源双链步骤进行PCRGottwaldetal.,2009,BMCResNotes,258：[0296]PCR产物用dsDNA裂解试剂盒消化并使用MutationDiscoveryKit和Gel-dsDNA试剂试剂盒在AdvanCETMFS96系统上根据厂商指导AdvancedAnalytical,IA,USA进行分析。[0297]RNA提取、PCR和定量实时RT-PCR[0298]使用Trizol方法（ChomczynskiandSacchi，1621987,AnalBiochem,156-159从根、叶中分离总RNA，根据厂商指导通过PicopureRNA分离试剂盒Arcturus从花药在减数分裂和成熟花粉发育之间的显微镜下分期）、心皮、胚乳和胚中分离。使用GAPDH引物见表3通过PCR证实不存在基因组DNA污染。1Ομί的PCR混合物含有Ιμΐ的cDNA模板、5μ1的2XPowerSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystems、0.33mM的每个基因的正向和反向引物（见表3。反应在AppliedBiosystems7900HTFastReal-TimePCR系统中进行。使用如下条件进行PCR:95°C进行10分钟，随后是在95°C进行15秒、在60°C退火温度进行60秒的40次循环。对于每个cDNA样品进行三次技术复制。快速实时PCR系统和数据使用SDS软件V2.2.2分析。将每个基因的转录水平根据如下公式标准化为GAPDH=R=2etHWX，其中R=相对改变，GOI=感兴趣的基因，H=管家GAPDH。这两种引物的特异性和效力使用克隆的全长大麦α和KENH3基因的系列稀释的质粒通过qRT-PCR确定。等量质粒的相似Ct值在报道蛋白染料的荧光信号超过背景水平的PCR循环表明这两种引物均可以相同效力扩增特异性转录物。[0299]表3[0301]对于两种大麦CENH3变体仅鉴别了错义点突变。[0302]使用CENH3变体特异性抗体通过对着丝粒进行免疫染色检测纯合M2突变体的突变的CENH3s的非功能性。对大麦野生型和纯合的TILLING株系4528根据本发明的植物）的有丝分裂和减数分裂染色体使用特异于aCENH3和KENH3的抗体进行免疫染色。在着丝粒的αCENH3和βCENH3信号在所有突变体中均显示，仅在氨基酸位置92SEQIDNo.36、即在SEQIDNo.1所示共有序列氨基酸位置4的亮氨酸取代为苯丙氨酸的纯合的TILLING株系4528，显示为在有丝分裂、减数分裂和间期细胞中无着丝粒PCENH3信号。在大麦i3-CENH3序列的SEQIDNo.36所示氨基酸位置92的亮氨酸取代为苯丙氨酸对应于在大麦i3-CENH3cDNA序列SEQIDNo.35位置274的C取代为T的单一核苷酸取代。[0303]在整个株系中发现在着丝粒外的仅微弱分散的KENH3信号。测量a和0CENH3在野生型（cvBarkeSEQIDno.33和34及在具有突变的KENH3的TILLING株系4528中的转录水平。在不同组织中使用特异性引物（表3测量α和0CENH3的相对表达水平。从总RNA制备cDNA，并将基因表达水平标准化为磷酸甘油脱氢酶（GRPTA的表达水平。显然，突变的βCENH3变体的着丝粒荷载似乎受损，而发现野生型与突变的0CENH3之间的转录水平无差异。因此，只由aCENH3组成的着丝粒在大麦中足以发挥有丝分裂着丝粒功能，因为发现没有明显的染色体分离缺陷如后期桥以及倍性或周期值改变。此外，在突变体植物中观测到植物习性没有明显改变。特别地，在纯合植物TILLING株系4528与大麦野生型之间的表型、倍性水平、周期值和生长表型中检测不到显著差异。[0304]需要解决失去的KENH3是否由额外aCENH3补偿以维持突变体中着丝粒的功能的这个问题。因此，通过像素强度测量对野生型（测量126个着丝粒和株系4528测量56个着丝粒）的aCENH3免疫染色信号进行量化对比。突变体中aCENH3增加19.8%表明失去的0CENH3通过额外掺入aCENH3而部分补偿。KENH3突变位于由组蛋白折叠的部分a1螺旋、环1和a2螺旋限定的进化高保守的靶向结构域CATD。这个结构域是通过伴侣蛋白经着丝粒荷载CENH3所需要的。[0305]间接免疫染色[0306]如先前所述进行核及染色体的间接免疫染色（Saneietal.，1082011,ProcNatlAcadSciUSA，E498-505。使用豚鼠抗-aCENH3-特异性和兔抗-KENH3-特异性抗体检测大麦的CENH3。兔HTR12-特异性抗体（abcam，ab72001用于检测拟南芥CENH3AtCENH3。用制冷的（cooledCCD-相机ORCA-ER，Hamamatsu记录荧光显微镜信号。通过使用OlympusBX61显微镜和ORCA-ERC⑶相机Hamamatsu进行成像。为了分析免疫信号和核染色质的结构，应用在光学分辨率为〜IOOnm超级分辨率的StructuredIlluminationMicroscopySM，使用Elyra显微镜系统的C-Apo63x1.2WKorr物镜和软件ZENZeiss,Germany进行。使用合适的激发和发射滤器，对于每个荧光物单独捕获图像。将图像使用AdobePhotoshop6.0软件合并。为了确定核中α和0CENH3荧光强度中的量，使用TINA2.0软件通过ZEN软件从样本的光学SIM截面堆栈中产生的以最大强度投影测量荧光强度。设定强度阈值以从图片中计算性减去背景像素。在核内的所有信号的灰度值的校正的总和用于确定CENH3含量。使用ZEN软件基于S頂图片堆叠进行3D渲染。[0307]实施例2:拟南芥[0308]为了论证CATD结构域中的突变导致观测到受损的着丝粒荷载，将eYFP与拟南芥CENH3SEQIDNo.37，蛋白质SEQIDNo.38的编码序列（CDS在N末端融合，拟南芥CENH3中具有LI亮氨酸异亮氨酸）（CDS:SEQIDNo.39,蛋白质：SEQIDNo.40或者LF亮氨酸苯丙氨酸）（CDS:SEQIDNo.41，蛋白质：SEQIDNo.42相应位置交换L130I或L130F，对应于在大麦的KENH3氨基酸位置92,S卩SEQIDNo.1所示共有序列的氨基酸位置4。在拟南芥的位置130的亮氨酸取代为异亮氨酸对应于在SEQIDNo.37的位置388的C取代为A的单一核苷酸取代。[0309]在位置130的氨基酸亮氨酸取代为苯丙氨酸是由于在SEQIDNo.37的位置387和388的两个核苷酸取代即TC取代为AT所致。[0310]用相应的抗野生型CENH3和抗GFP的双重标记转基因拟南芥显示，突变的CENH3的着丝粒革El向显著降低。[0311]接着，为了检测单倍体诱导物能力，将具有L130I或L130F交换的拟南芥基因组CENH3构建体用于转化杂合的CENH3敲除拟南芥植物RaviandChan，Nature，4642010，615-618。基因型分型鉴别纯合CENH3无效突变体，其由基因组CENH3野生型、L130I或L130F构建体补足。由于获得含有任一构建体的存活的二倍体植物，很可能这个突变在纯合的拟南芥植物中不削弱着丝粒功能。当将表达点突变的L130FCENH3蛋白质的CENH3无效突变体与野生型杂交时，来自突变体的染色质被消除，产生单倍体后代。流式细胞分析证实10.7%的Fl植物是单倍体。[0312]CENH3转基因的克隆与产生[0313]为了产生具有导致苯丙氨酸130F130和异亮氨酸1301130代替野生型亮氨酸130L130的突变的CENH3基因组片段，将用于补足Cenh3-1Cenh3-1cenh3无效突变体）的PCAMBIA1300载体中基因组CENH3片段（RaviandChan，Nature，4642010，615-618;RavietaL·,Genetics,1862010,461-471通过唯一的HindIII和BamHI位点亚克隆进pBlueScriptIIKSStrategene，www.stratagene·com〇在pBlueScriptIIKS中使用Ph.USkm®定向诱变试剂盒Finnzymes，www.finnzymes.com根据厂商指导略加改变产生CENH3的突变1^1301或1^13^。下列5’-磷酸化的引物用于诱变：：!134+1^130_?_€〇『、CENH3L130_I_for和CENH3L130_F+I_rev。将突变的CENH3基因组片段通过唯一的HindIII和BamHI位点亚克隆进含有潮霉素抗性标记的初始pCAMBIA1300中。所有构建体通过测序核实。引物见上表3。[0314]为了产生含有在CENH3CDS内导致L130I或L130F的突变的p35S::eYFP-CENH3融合构建体，将含有p35S::eYFP-CENH3表达Lermontova,182006,PlantCell，615-618的质粒p35S-BM，Schmidt，www.dna_cloning.com用作pi.lusi〇nR定向诱变试剂盒Finnzymes，www.finnzymes.com的模板。导入希望的突变的引物和策略与上述相同。将获得的表达盒35Spro，eYFP-突变的）CENH3和NOS终止子通过唯一的SfiI限制位点亚克隆进含有草丁膦抗性标记的PLH7000载体中（Schmidt，www.dna-cloning.com，并通过测序核实。[0315]植物转化、培养条件和异花授粉[0316]将拟南芥A.thaliana野生型（SEQIDNo·37和38及cenh3-lCENH3杂合子植物均登记为Columbia-0通过蘸花法转化CloughandBent，161998，PlantJ,735-743〇在含有相应抗生素的Murashige和Skoog固体培养基上选择转基因后代。使植物在培养皿上在长日照条件20°C16h光照18°C8h黑暗）下发芽，在短日照条件20°C8h日照18°C16h黑暗）下生长4周，然后再移至长日照条件下。对于杂交，将突变的cenh3A.thaliana的闭合的花蕾通过用镊子除去未成熟的花药而去雄。去雄的花蕾的柱头用来自新开放的野生型拟南芥花的成熟花药的淡黄色花粉授粉。[0317]拟南芥的DNA提取及基因型分型[0318]使用标准方法进行基因组DNA制备和基于PCR的基因型分型。根据Edwardsetal.1991,NucleicAcidsRes19,1349所述提取DNA。[0319]在dCAPS基因型分型反应中对植物进行cenh3_l的基因型分型。使用dCAPS引物cenh3_l_mut_for和cenh3_l_mut_rev扩增CENH3。扩增子用EcoRV消化，并在凝胶上分辨resolvedΑθη1ι3-1突变体等位基因未切割（215bp，而WTCENH3等位基因被切割（191和24bp。引物见表3。为了在用CENH3基因组基因座L130、L130I或L130F未标记的CENH3转基因）转化的cenh3-lCENH3植物子代中对内源CENH3基因座进行cenh3-l基因型分型，使用转基因CENH3基因座之外的引物进行初始PCR反应，使得内源的而不是转基因的CENH3基因座特异性扩增。使用的引物是cenh3_l_mut_for和cenh3_ljiiutSSSOrcenhS-ljiiutSASgrj1^化扩增子并用作如上述cenh3-l植物的第二个dCAPSPCR基因型分型反应的模板。引物见表3。通过PCR核实转基因的存在。[0320]植物和种子的流式细胞分析[0321]对于植物的流式细胞倍性分析，在补加了DNas-freeRNase50ygml和碘化丙啶50ygml核分离缓冲液中（Galbraithetal.1983,Science220,1049-1051用锋利刀片将5-10个个体的等量叶材料同时割下。将该核悬浮液通过35μπι细胞过滤器盖过滤进5ml聚苯乙稀管中（BDBiosciences，并在装备了氩离子激光器INNOVA90CCoherent的FACStarpujs细胞分选仪BDBiosciences上测量。测量大约10，000个核，并使用软件CELLQuestver.3.3BDBiosciences分析。所得柱状图与代表二倍体野生型植物的参考柱状图对比。在检测到在单倍体位置出现另外的峰的情况中，将植物单独再次测量以鉴定单倍体个体。[0322]如上所述使用核分离缓冲液MAVIIOOmMTris-HCl，5.3mMMgCl2，86mMNaCl，30.6mM梓檬酸钠，1.45mMTritonX-100，pH7.0;补加50ygmlDNas-freeRNase和50ygml碘化丙啶进行种子的核分离。核悬浮液在FACSAria细胞分选仪BDBiosciences上测量，并使用FACSDiva软件ver.6.1.3BDBiosciences分析。与上文所述相似，集合前10-20个种子以鉴别具有单倍体胚的株系，及在第二步中将单一的种子与萝卜（GenebankGatersleben，登记号RA34的叶材料一起切碎，作为内部参考以证实单倍体种子的存在。[0323]实施例3:甜菜[0324]进一步地，也在甜菜中测定鉴别的突变的功能意义。产生RFP报道蛋白构建体，其含有甜菜CENH3的cDNASEQIDNo.43,蛋白质SEQIDNo.44，具有L106FSEQIDNo.45，蛋白质SEQIDNo.46或者L106ISEQIDNo.47,蛋白质SEQIDNo.48交换（对应于大麦的氨基酸位置92，SEQIDNo.1所示共有序列的氨基酸位置4，并用于甜菜的稳定转化及检测突变的CENH3的降低的着丝粒靶向。[0325]在位置106的亮氨酸取代为苯丙氨酸的氨基酸取代是由于两个核苷酸取代所致，即在SEQIDno.43的位置316的C取代为T及在位置318的G取代为T。[0326]在位置106的亮氨酸取代为异亮氨酸的氨基酸取代是由于两个核苷酸取代所致，即在SEQIDno.43的位置316的C取代为A及在位置318G取代为T。[0327]植物转化与培养条件[0328]将6-8周龄甜菜野生型植物叶（在半控温室条件下生长通过微粒轰击用0.5yg质粒DNA包被的300yg金微粒）进行瞬时转化。将经轰击的叶保温48-72小时（25°C，16h光照350ymolm—2s—38h黑暗），之后进行显微镜分析。如LindseyGallois,1990Journalofexperimentalbotany,415,529-536所述进行甜菜愈伤组织的稳定转化通过卡那霉素选择）。在大约2个月后（24°C，16h光照（δδμπιοΙπ^ίΓ18h黑暗），经显微镜分析愈伤组织细胞。[0329]CENH3转基因的克隆与世代[0330]为了产生35S::RFP-CENH3融合构建体，使用如下引物从甜菜cDNA中扩增CENH3:BvCENH3-cdsl:GGATCCATGAGAGTTAAACACACTGCSEQIDNo.16,BvCENH3-cds2:GGATCCTGTTCAGTTACCATCCCCTCSEQIDNo.17，克隆进含有35Spro、RFP和35S-终止子表达盒的载体中。对于含有在CENH3编码序列内导致F106和1106代替L106的突变的构建体，含有35S::RFP-CENH3表达盒的上述质粒用作进行基于引物的诱变的模板。接近希望的突变位置的Ps11位点用于将CENH3分成两部分。通过引物中的突变，整合希望的突变：[0334]所得表达盒35Spro，RFP-突变的）CENH3和35S-终止子通过测序核实。[0335]在甜菜中分析CENH3结合[0336]为了分析CENH3与突变的CENH3的结合，使用AxioImagerM2显微镜系统的C-Apo63xl.2WKorr物镜和软件ZENZeiss,Germany分析叶或愈伤组织材料。[0337]实施例4:其它CENH3突变体的鉴别和检测[0338]为了鉴别CENH3的内源基因内其它单一点突变，其导致翻译的CENH3序列的氨基酸取代或者缺失一或多个氨基酸。即使Ravi和Chan2010仅强调N末端结构域的特殊重要性，但是在另一部分CENH3如α2-螺旋中对于突变的上述研究（实施例1-3表明CENH3的CATD结构域的修饰可导致CENH3与DNA的结合能力不稳定。因此，关注点是CATD内、特别是环1和α2-螺旋中其它突变的鉴别。此外，应证实由于物种之间CATD结构域的高水平保守所致，鉴别的突变具有赋予不同植物物种单倍体诱导物生物活性的潜力。[0339]对于两种其它单子叶植物即玉米和高粱及对于两种双子叶植物即甘蓝型油菜和甜菜产生了具有高突变比率的TILLING种群。为了筛选内源CENH3基因中导致翻译的CENH3蛋白质的CATD结构域中至少一个氨基酸取代或者缺失至少一个氨基酸的突变，如上文针对大麦示例描述实施例1分别产生覆盖CENH3基因的全部外显子以及部分相应内含子的扩增子，通过Sanger测序方法分析每个植物物种的1000-10000个体。此外，使用特异性PCR检测M2甜菜植物的突变。[0340]进一步地，CENH3基因内鉴别的突变对于编码的蛋白质的初级结构和二级结构的影响使用Prof软件等评估（Rost,B.andSander，C.1994a.Combiningevolutionaryinformationandneuralnetworkstopredictproteinsecondarystructure.Proteins,19I,55-72.RostjB.andSanderjC.1994b.Conservationandpredictionofsolventaccessibilityinproteinfamilies.Proteins,203,216-26.Rost,B.,Casadio,R.,Fariselli,P.,andSander,C.1995.Transmembranehelicespredictedat95%accuracy.ProteinSci,43,521-33.〇[0341]纯合突变体的突变的CENH3的无功能性non-functionality例如如上述通过用CENH3特异性抗体对着丝粒进行免疫染色进行检测实施例1和2。鉴别的TILLING株系示出突变的CENH3的显著降低或受损的着丝粒荷载。具有对于这种突变杂合的基因组的植物是可存活的，且未观测到植物习性显著改变，即关于统计学精确性，表型、倍性水平、周期值和生长与相应野生型植物相当。[0342]通过将突变体植物与相同物种的检测植物杂交评估鉴别的突变体中单倍体诱导物的生物活性。检测植物携带野生型形式CENH3。检测单倍体诱导的母本以及父本性能。为此，突变体植物在与检测植物杂交中用作胚珠亲本或者用作花粉亲本。如果使用的检测植物株系携带隐性非-CENH3突变，则从这个杂交中推定的单倍体后代可以迅速确定。如此，单倍体植物示出隐性表型。例如，在玉米中可以使用突变glossy的表现Mutantsofmaize,Neuffer，MGetal.1997.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork。如果使用的检测植物株系携带隐性非-CENH3突变，这些杂交的单倍体后代可以迅速确定。如此，单倍体植物示出隐性表型。例如在玉米中可以使用突变glossy的表现Mutantsofmaize,Neuffer,MGetal.1997.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork〇[0343]此外，使用诱导物的有丝分裂和减数分裂的细胞发生学分析表明作为单倍体诱导物的突变体的适合性，及纯合性通过使用分子标记、检测植物的多形性及潜在的诱导物确定。这种单倍体可以经细胞遗传学检测。[0344]下列表格示出赋予所研究的植物物种单倍体诱导物生物活性的错义和缺失突变。[0345]表4:来源于甘蓝型油菜的CENH3的突变aa:氨基酸，nd:未确定，y:是，η:否）。氨基酸取代以Χ#γ示出，即在位置#氨基酸X单字母代码）由氨基酸Y取代。[0348]表5:来源于玉米的CENH3的突变aa:氨基酸，nd:未确定，y:是，η:否）。氨基酸取代以Χ#Υ示出，即在位置#氨基酸X单字母代码）由氨基酸Y取代。[0350]表6:来源于高粱的CENH3的突变aa:氨基酸，nd:未确定，y:是，η:否）。氨基酸取代以X#Y示出，即在位置#氨基酸X单字母代码）由氨基酸Y取代。[0352]表7:来源于甜菜的CENH3的突变aa:氨基酸，nd:未确定，y:是，η:否）。氨基酸取代以Χ#Υ示出，即在位置#氨基酸X单字母代码）由氨基酸Y取代。[0355]与检测植物杂交，具有突变的内源CENH3的TILLING植物产生至少0.5%的单倍体后代。例如，在甘蓝型油菜中，突变C153Y和Al54V示出在0.5%-1%之间的诱导率。在少数情况中，可以达到2%或更高的诱导率。通常地，如果检测植物在杂交中用作雄性亲本则诱导率较高。[0356]此外，杂交结果证实鉴别的突变在其它植物物种也可以具有功能性。因此，在SEQIDNo.1所示共有序列的氨基酸位置4的突变，由此亮氨酸被取代为苯丙氨酸，如实施1-3所示在大麦L92F中产生诱导活性，在甘蓝型油菜L132F中也如此。因此，通过如TILLING、诱变或者基因组编辑例如CRISPRCas，TALENs，锌指核酸酶等等技术可以将突变导入其它植物物种中。此外，单倍体诱导物的生物活性和效力通过在一个植物中组合不同的鉴别的突变和或修饰单倍体诱导物的遗传背景而可以进一步改良。不同突变的组合可以通过基因组编辑有效实现，或者突变体单倍体诱导物再次被诱变。

权利要求：1.植物，具有单倍体诱导物生物活性并且包含编码包含CATD结构域的着丝粒组蛋白H3CENH3蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在CATD结构域中导致CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变，所述改变赋予单倍体诱导物生物活性。2.权利要求1的植物，其中所述突变在SEQIDNo.38所示的来源于拟南芥ArabidopsisthaIiana的CENH3蛋白质的环1中导致赋予单倍体诱导物生物活性的改变，所述环1对应于SEQIDNo.37的位置340-378的核苷酸并且位于CATD结构域内，或者所述突变在SEQIDNo.38所示的来源于拟南芥的CENH3蛋白质的α2-螺旋中导致赋予单倍体诱导物生物活性的改变，所述α2-螺旋对应于SEQIDNo.37的位置379-465的核苷酸并且位于CATD结构域内。3.权利要求1或2的植物，其中所述突变导致表1或2所示的确定的氨基酸的取代或缺失。4.前述权利要求任一项的植物，其中所述突变导致SEQIDNo.1或49的确定的氨基酸的取代或缺失。5.前述权利要求任一项的植物，其中所述植物与野生型植物或者表达野生型CENH3蛋白质的植物之间的杂交产生至少0.1%的单倍体后代。6.前述权利要求任一项的植物，其中包含所述突变的核苷酸序列是内源基因或者转基因。7.权利要求6的植物，其中包含所述突变的核苷酸序列是转基因，并且编码CENH3蛋白质的至少一个内源基因被失活或者敲除。8.前述权利要求任一项的植物，其中在SEQIDNo.49的位置2的氨基酸天冬酰胺被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.55的位置95的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.49的位置6的氨基酸脯氨酸被取代，优选取代为丝氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置121的氨基酸脯氨酸被取代，优选取代为丝氨酸，或者在SEQIDNo.49的位置12的氨基酸色氨酸被取代，优选取代为终止信号，或者在SEQIDNo.52的位置127的氨基酸色氨酸被取代，优选取代为终止信号，或者在SEQIDNo.1的位置1的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.58的位置107的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置4的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为苯丙氨酸、异亮氨酸或者谷氨酰胺，或者在SEQIDNo.52的位置132或者在SEQIDNo.34的位置92或者在SEQIDNo.38的位置130或者在SEQIDNo.61的位置106的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为苯丙氨酸、异亮氨酸或者谷氨酰胺，或者在SEQIDNo.1的位置7的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为脯氨酸，或者在SEQIDNo.61的位置109的氨基酸亮氨酸被取代，优选取代为脯氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置8的氨基酸谷氨酰胺被取代，优选取代为终止信号或亮氨酸，或者在SEQIDNo.58的位置114或者在SEQIDNo.61的位置110的氨基酸谷氨酰胺被取代，优选取代为终止信号或亮氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置10的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置138的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为苏氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置25的氨基酸半胱氨酸被取代，优选取代为酪氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置153的氨基酸半胱氨酸被取代，优选取代为酪氨酸，或者在SEQIDNo.1的位置26的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸，或者在SEQIDNo.52的位置154的氨基酸丙氨酸被取代，优选取代为缬氨酸。9.前述权利要求任一项的植物的部分，其优选是芽营养器官、根、花或花器官、种子、果实、胚珠、胚、植物组织或细胞。10.单倍体植物，可通过权利要求1-8任一项的植物与表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交获得。11.双单倍体植物，可通过将权利要求10的单倍体植物转变为双单倍体植物获得，优选通过秋水仙素处理获得。12.—种产生单倍体植物的方法，包括如下步骤：a将权利要求1-8的植物与表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，及b鉴别从杂交步骤产生的单倍体后代植物。13.—种产生双单倍体植物的方法，包括如下步骤：a将权利要求1-8的植物与表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，b鉴别从杂交步骤中产生的单倍体后代植物，及c将所述单倍体后代植物转变为双单倍体植物，优选通过秋水仙素处理或者通过染色体自然加倍法转变。14.促进细胞质交换的方法，包括如下步骤：X将作为胚珠亲本的权利要求1-8的植物与作为花粉亲本的表达野生型CENH3蛋白质的植物杂交，及y获得包含所述花粉亲本染色体和胚珠亲本细胞质的单倍体后代植物。15.—种产生权利要求1-8的植物的方法，包括如下步骤：i对植物种子进行足量诱变剂甲基磺酸乙酯处理以获得Ml植物，ii充分产生可育的M2植物，iii分离M2植物的基因组DNA，及iv选择在CENH3的CATD结构域中具有氨基酸序列改变的个体。16.核苷酸序列，编码CENH3蛋白质的至少CATD结构域，包含在CATD结构域中导致CENH3蛋白质的氨基酸序列改变的突变。17.载体，包含权利要求16的核苷酸序列。18.植物细胞或宿主细胞，包含权利要求16的核苷酸序列或者权利要求17的载体作为转基因。19.一种产生权利要求1-8的植物的方法，包括如下步骤：yy用权利要求16的核苷酸序列或者权利要求17的载体转化植物细胞，及zz从所述植物细胞再生具有单倍体诱导物生物活性的植物。

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