申请/专利权人：上海植物园

申请日：2019-05-31

公开（公告）日：2024-02-27

公开（公告）号：CN110129336B

主分类号：C12N15/29

分类号：C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/20

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.27#授权;2019.09.10#实质审查的生效;2019.08.16#公开

摘要：本发明公开了一种如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本发明的铁线莲ClHSP18基因在拟南芥中可以实现异源表达，提高拟南芥的热激胁迫抗性。

主权项：1.一种氨基酸序列，其序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：铁线莲CLHSP18基因编码序列及其应用技术领域本发明涉及植物分子生物学领域，具体的说涉及铁线莲CLHSP18基因编码序列及其应用。背景技术由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。热激蛋白heatshockprotein,HSPs是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，根据分子质量大小将其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子热激蛋白smHSPs。热激蛋白是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。有机体在受到逆境胁迫后，体内变性蛋白急剧增加，热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态,在有Mg2+和ATP的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象。已有研究证明HSPs的主要功能是参与新生肽的折叠以及蛋白质变性后的复性、降解，维持胞内环境的稳定，起分子伴侣molecularchaperones的作用。虽然植物热激蛋白的研究起步较晚，但已成为当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容，其中心问题是HSPs的生物学功能。许多研究表明，HSPs的生成量与生物耐热性呈正相关。Alvaro等1999实验证明，将栗子CastaneasativaCsHSP17.5基因转入大肠杆菌显著提高转基因菌株对高温50℃及低温4℃的耐受性。随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。铁线莲属ClematisfloridaThunb为毛茛科Ranunculaceae直立灌木、草本，木质或草质藤本，是一类观赏价值高、具有多种抗逆性的藤本植物。全世界约有铁线莲属植物335种，广泛分布于除南极洲以外的各大洲。中国铁线莲属植物极其丰富，约有147种，全国各地均有分布，大部分种类分布于华中和西南地区。铁线莲喜凉爽气候，在野生环境中常与灌木伴生。上海地区近5年2014—2018年夏季持续的高温35℃以上天气多达1个月左右，严重影响了铁线莲的生长，如叶片变黄、萎蔫、脱落，茎干还易感枯萎病，限制了铁线莲在上海地区的大面积推广应用。因此，如何提高铁线莲品种耐热性是园林工作者面临的重要任务。已有研究表明小分子热激蛋白基因是一类胁迫诱导表达基因，它在耐热品种中诱导表达可以明显提高品种的耐热性，该类基因的挖掘与应用在园林植物及其它植物的抗逆研究中具有非常重大的应用前景。发明内容本发明的目的首先在于提供一种如SEQIDNO.1的铁线莲CLHSP18基因；该铁线莲CLHSP18基因是一种小分子热激蛋白基因，该基因长度为471bp。本发明还提供了一种如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；其编码的蛋白质分子量为17959.49道尔顿，pI为8.113。本发明还提供了包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链的重组表达载体。本发明还提供了包含如上述重组表达载体的宿主细胞。本发明还提供了上述铁线莲ClHSP18基因的克隆方法，包括如下步骤：①提取铁线莲的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；②根据同源序列设计简并引物，正向引物：5’-CATTCRCTGAATHTCCTG-3’SEQIDNO.3反向引物：5’-AACMTCCTGGAGKACTTG-3’SEQIDNO.4；利用简并引物，采用RT-PCR方法从cDNA中扩增出一条247bp的条带；进行测序分析获得碱基序列；③利用步骤②中得到的片段序列，设计三对反向PCR引物；第一对反向PCR引物：SEQIDNO.5正向引物5’-TGTCAACGTTGAGATTGA-3’，SEQIDNO.6反向引物5’-TGATGAAAGCCGTATTCT-3’；第二对反向PCR引物：SEQIDNO.7正向引物5’-TGCTGCAGATCAGCGGCC-3’，SEQIDNO.8反向引物5’-AATTCAGGGAATGTGGCG-3’；第三对反向PCR引物：SEQIDNO.9正向引物5’-CAAGTTCTCCAGGAGGTT-3’，SEQIDNO.10反向引物5’-AGGGAATTGGAAATCCCT-3’；④提取铁线莲的基因组DNA；⑤用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，纯化并回收酶切后的片段，以T4连接酶催化片段首尾自连成环；以自连后的片段作反向PCR模板，以三对反式PCR引物的反向引物分别进行三轮巢式PCR，获得一427bp片段为5’端；⑥3’-RACE获得ClHSP18基因3’端用3’-RACE反转录试剂盒将铁线莲总RNA反转录成cDNA作3’-RACE模板，以上述3对反式PCR引物的正向引物5’-3’分别与3’-RACE引物AUAP配对进行三轮巢式PCR；回收获得的327bp片段；⑦全长基因的克隆根据上述②、⑤、⑥获得的序列片段进行拼接，获得该基因的cDNA全长序列；依据基因5’、3’端序列设计基因全长引物SEQIDNO.11和SEQIDNO.12的引物，采用RT-PCR方法从铁线莲cDNA中扩增出一条471bp的条带；将该471bp的PCR产物回收，连接到T-Vector上，转化大肠杆菌，进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和月季小分子热激蛋白基因RcHSP17.8序列高度保守。本发明还提供了上述铁线莲ClHSP18基因在拟南芥中异源表达应用，该应用可以提高拟南芥的热激胁迫抗性。本发明提供了铁线莲中表达的ClHSP18铁线莲小分子热激蛋白，clematissmallHeatshockprotein，ClHSP18基因序列，其编码的核苷酸序列，转基因载体的构建，拟南芥的转化，转基因植株的获得及其耐热性能鉴定。本发明提供了从铁线莲中克隆小分子热激蛋白基因，并转入拟南芥后提高转基因拟南芥对高温抗性的技术。附图说明图1铁线莲ClHSP18编码的蛋白质序列与月季RcHSP17.8蛋白的氨基酸序列同源性比较铁线莲ClHSP18与月季RosachinensisRcHSP17.8氨基酸序列GenBankAccessionNo.ABK32539.1的同源性比较FASTA表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出图2半定量RT-PCR检测铁线莲ClHSP18的表达其中上图为RT-PCR扩增产物，下图为相应的actin对照lane1:‘金斯托韦克’25℃常温；lane2:‘波兰精神’25℃常温；lane3:‘金斯托韦克’38℃热激；lane4:‘波兰精神’38℃热激图3转基因拟南芥热激胁迫抗性比对左边为野生拟南芥，右边为转基因拟南芥。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册NewYork：ColdSpringHarborLabortaryPress，1989中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1铁线莲CLHSP18基因的克隆1.将耐热的铁线莲品种‘波兰精神’PolishSpirit上海植物园进行38℃热激3小时，提取嫩叶片的总RNA，提取试剂盒为植物RNAout试剂盒四川绵阳高新区天泽基因工程有限公司，利用反转录试剂盒TaKaRa，中国大连将总RNA反转录成cDNA。2.根据月季RcHSP17.8登录号：EF053229.1与菟丝子CjHSP17.6登录号：AB017273同源序列设计简并引物，正向引物：5’-CATTCRCTGAATHTCCTG-3’SEQIDNO.3反向引物：5’-AACMTCCTGGAGKACTTG-3’SEQIDNO.4。采用RT-PCR方法从‘波兰精神’cDNA中扩增出一条247bp的条带。将PCR产物回收，连接到T-VectorTaKaRa，中国大连上，转化大肠杆菌DH5α，TaKaRa，D9057A，进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和月季小分子热激蛋白基因RcHSP17.8的核苷酸序列高度保守。利用片段序列中设计3对反向PCR引物。第一对反向PCR引物：SEQIDNO.5正向引物5’-TGTCAACGTTGAGATTGA-3’，SEQIDNO.6反向引物5’-TGATGAAAGCCGTATTCT-3’；第二对反向PCR引物：SEQIDNO.7正向引物5’-TGCTGCAGATCAGCGGCC-3’，SEQIDNO.8反向引物5’-AATTCAGGGAATGTGGCG-3’；第三对反向PCR引物：SEQIDNO.9正向引物5’-CAAGTTCTCCAGGAGGTT-3’，SEQIDNO.10反向引物5’-AGGGAATTGGAAATCCCT-3’；3.基因组DNA的提取取‘波兰精神’嫩叶片，研成液氮粉，立即加入预热的提取缓冲液，65℃保温25min，离心，上清以等体积的氯仿异戊醇241抽提2次，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两次，最后用TE溶解DNA；加入RNaseA0.5μgmlTaKaRa，中国大连，65℃消化RNA1h；用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。4.用限制性内切酶EcoRITaKaRa，中国大连对基因组DNA进行充分酶切，纯化并回收酶切后的片段，以T4连接酶TaKaRa，中国大连催化片段首尾自连成环。以自连后的片段作反向PCR模板，以3对反式PCR引物进行三轮巢式PCR，获得一427bp片段，回收、纯化，连接到T-Vector上，测序，序列分析后获得基因的5’端序列。5.3’-RACE获得ClHSP18基因3’端用3’-RACE反转录试剂盒TaKaRa，中国大连将‘波兰精神’嫩叶总RNA反转录成cDNA作3’-RACE模板，以上述3对反式PCR引物的正向引物5’-3’分别与3’-RACE引物AUAPTaKaRa，中国大连配对进行三轮巢式PCR；回收获得的327bp片段，纯化，连接到T-Vector上，测序，序列分析后获得基因的3’端序列。6.全长基因的克隆根据上述2、4、5获得的序列进行拼接，获得该基因的cDNA全长序列，即开放阅读框ORF。依据基因5’、3’端序列设计基因全长引物SEQIDNO.11和SEQIDNO.12的引物，采用RT-PCR方法从‘波兰精神’cDNA中扩增出一条471bp的条带。将PCR产物回收，连接到T-Vector上，转化大肠杆菌，进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和月季小分子热激蛋白基因RcHSP17.8序列高度保守，具体请看表1。其中全长引物：SEQIDNO.11正向引物5’-ATGTCGCTTATCCTAAGT-3’，SEQIDNO.12反向引物5’-TTACGCAGTAAGATCAAT-3’表1铁线莲ClHSP18基因核苷酸序列与月季RcHSP17.8基因核苷酸序列的同源性比较其中，Query为铁线莲ClHSP18基因核苷酸序列；Sbjct为月季RcHSP17.8基因核苷酸序列GenBankAccessionNo.EF053229.1实施例2铁线莲ClHSP18基因的序列信息与同源性分析实施例1得到的铁线莲ClHSP18基因长度为471bp，详细序列见SEQIDNO.1。该基因编码的多肽由156个氨基酸残基组成，分子量为17959.49道尔顿，pI为8.113。详细序列见SEQIDNO.2。将铁线莲ClHSP18全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序在Non－redundantGeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non－redundantGeneBankCDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与月季RosachinensisRcHSP17.8存在较高的同源性。在核苷酸水平上，它与月季RosachinensisRcHSP17.8基因的mRNA编码序列GeneBankAccessionNo.EF053229.1有一定的同源性见表1，在氨基酸水平上，它与月季RosachinensisRcHSP17.8氨基酸序列GenBankAccessionNo.ABK32539.1的氨基酸残基有87.74％的相似性见图1。说明该铁线莲ClHSP18基因与月季RosachinensisRcHSP17.8基因存在较高的同源性。实施例3铁线莲ClHSP18表达模式分析用RT－PCR的方法检测分别取25℃常温及38℃热激3h的‘波兰精神’PolishSpirit和‘金斯托韦克’StolwijkGold上海植物园嫩叶提取总RNA，反转录成cDNA，然后根据铁线莲ClHSP18基因全长序列设计一对引物，正向引物5’-ATGTCGCTTATCCTAAGT-3’，反向引物5’-TTACGCAGTAAGATCAAT-3’，进行PCR。电泳之后，用相对定量软件天程公司进行分析。结果表明，常温下，铁线莲ClHSP18基因在两个铁线莲品种中均不表达，在热激后‘波兰精神’表达而‘金斯托韦克’不表达图2。实施例4铁线莲ClHSP18基因在拟南芥中异源表达提高了转基因拟南芥热激胁迫抗性1含目的基因铁线莲ClHSP18植物表达载体pCAMBIA1300-ClHSP18的构建以铁线莲ClHSP18基因的ORF设计引物：正向引物5’-ATGTCGCTTATCCTAAGT-3’，反向引物5’-TTACGCAGTAAGATCAAT-3’。正向引物引入EcoRI酶切位点，反向引物引入XbaI酶切位点。以实施例1中获得的耐热品种‘波兰精神’cDNA为模板，进行PCR扩增；割胶回收PCR产物，连接到T-VectorTaKaRa，中国大连构建成重组质粒T-ClHSP18；转化大肠杆菌DH5αTaKaRa，D9057A，PCR检测阳性克隆，提取质粒T-ClHSP18；EcoRI、XbaI双酶切质粒T-ClHSP18，电泳分离，割胶回收酶切产物的小片段，与同样经EcoRI、XbaI双酶切的植物表达载体pCAMBIA1300TaKaRa，中国大连连接，构建pCAMBIA1300-ClHSP18重组质粒；转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，并测序证明插入片段ClHSP18序列正确，无移码发生；提取质粒pCAMBIA1300-ClHSP18。将重组表达载体质粒pCAMBIA1300-ClHSP18转化农杆菌GV3101TaKaRa，中国大连，以农杆菌浸染法浸花法转化拟南芥野生型Columbia，ArabidopsisBiologicalResourceCenter，美国俄亥俄州立大学花蕾；潮霉素15mgL德国进口，上海索来宝生物科技有限公司筛选阳性植株，获得T3代转基因pCAMBIA1300-ClHSP18拟南芥植株。选取花期的转基因pCAMBIA1300-ClHSP18拟南芥植株土培盆苗，进行42℃热激12小时后，转基因拟南芥植株pCAMBIA1300-ClHSP18未发生明显的形态变化而野生型拟南芥CK出现严重萎蔫图3，结果显示转基因拟南芥pCAMBIA1300-ClHSP18比野生型拟南芥CK具有更强的耐热性。表明铁线莲ClHSP18基因在拟南芥中异源过表达能提高转基因拟南芥对热激胁迫的耐性。序列表上海植物园铁线莲CLHSP18基因及其编码蛋白和应用12SIPOSequenceListing1.01471DNA铁线莲ClematisfloridaThunb1atgtcgcttatcctaagttaccgacgaaacagcgtcttcgacctcgatctctgggaccca60ttcagggatttccaattcccttcatcatctctcgccacattccctgaatttcctggcgag120aatacggctttcatcaacaccaggatcgcgtgagactggaagcagaccccagaagcccat180gtgttcaaggtcgaccttccggcgctgaagatagaagatgtcaacgttgagattgaaaat240gacagggtgctgcagatcagcggcctgaggaagatagagaaggaggacaagaacgacaag300tggcaccgggtcgatagaagcagctgcaagttctccaggaggttcaggcttcctgagaat360gcgaagcttgatgagattaaggctgctatggagaatggagttctcagggtgactgttcct420aaggcaaacgtgaagaggcctgatgtcaaagccattgatcttactgcgtaa4712155PRT铁线莲ClematisfloridaThunb2MetSerLeuIleLeuSerTyrArgArgAsnSerValPheAspLeuAsp151015LeuTrpAspProPheArgAspPheGlnPheProSerSerSerLeuAla202530ThrPheProGluPheProGlyGluAsnThrAlaPheIleAsnThrArg354045IleAlaAspTrpLysGlnThrProGluAlaHisValPheLysValAsp505560LeuProAlaLeuLysIleGluAspValAsnValGluIleGluAsnAsp65707580ArgValLeuGlnIleSerGlyLeuArgLysIleGluLysGluAspLys859095AsnAspLysTrpHisArgValAspArgSerSerCysLysPheSerArg100105110ArgPheArgLeuProGluAsnAlaLysLeuAspGluIleLysAlaAla115120125MetGluAsnGlyValLeuArgValThrValProLysAlaAsnValLys130135140ArgProAspValLysAlaIleAspLeuThrAla145150155318DNA人工序列ArtificialSequence3cattcrctgaathtcctg18418DNA人工序列ArtificialSequence4aacmtcctggagkacttg18518DNA人工序列ArtificialSequence5tgtcaacgttgagattga18618DNA人工序列ArtificialSequence6thathaaahcchtattct18718DNA人工序列ArtificialSequence7thctgcagatcagcggcc18818DNA人工序列ArtificialSequence8aattcagggaatgtggcg18918DNA人工序列ArtificialSequence9caagttctccaggaggtt181018DNA人工序列ArtificialSequence10agggaattggaaatccct181118DNA人工序列ArtificialSequence11atgtcgcttatcctaagt181218DNA人工序列ArtificialSequence12ttacgcagtaagatcaat18

权利要求：1.一种铁线莲CLHSP18基因，其序列如SEQIDNO.1所示。2.一种氨基酸序列，其序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于其包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链。4.一种包含如权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。5.一种权利要求1所述铁线莲ClHSP18基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：①提取铁线莲的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；②根据同源序列设计简并引物，正向引物‘的序列为SEQIDNO.3，反向引物‘的序列为SEQIDNO.4；利用简并引物，采用RT-PCR方法从cDNA中扩增出一条247bp的条带；进行测序分析获得碱基序列；③利用步骤②中得到的片段序列，设计三对反式PCR引物；其序列分别为：SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；④提取铁线莲的基因组DNA；⑤用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，纯化并回收酶切后的片段，以T4连接酶催化片段首尾自连成环；以自连后的片段作反向PCR模板，以三对反式PCR引物的反向引物分别进行三轮巢式PCR，获得一427bp片段为ClHSP18基因5’端；⑥3’-RACE获得ClHSP18基因3’端用3’-RACE反转录试剂盒将铁线莲总RNA反转录成cDNA作3’-RACE模板，以上述3对反式PCR引物的正向引物分别与3’-RACE引物AUAP配对进行三轮巢式PCR；回收获得的327bp片段；⑦全长基因的克隆；根据上述步骤②、⑤、⑥获得的序列片段进行拼接，获得该基因的cDNA全长序列；依据基因5’、3’端序列设计基因全长引物，全长引物的序列分别为SEQIDNO.11和SEQIDNO.12，采用RT-PCR方法从铁线莲cDNA中扩增出一条471bp的条带；经测序即为铁线莲ClHSP18基因。6.权利要求1所述的铁线莲ClHSP18基因在拟南芥中异源表达的应用。

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