申请/专利权人：云南省林业和草原科学院

申请日：2020-03-26

公开（公告）日：2024-03-15

公开（公告）号：CN111560339B

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/70;A01N63/20;A01P7/04

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.15#授权;2020.09.15#实质审查的生效;2020.08.21#公开

摘要：本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法，选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQIDNO.1，通过引物设计、flightin基因及对照egfp基因片段的克隆、构建桔小实蝇RNAi干扰表达载体、重组质粒转化大肠杆菌HT115以及dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达，获得桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液。本发明采用重组质粒可以在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA的方法，降低了实验成本，持续饲喂菌液后对桔小实蝇的飞行能力有抑制作用，具有广阔的应用前景。

主权项：1.桔小实蝇flightin基因的dsRNA细菌表达菌液，其特征在于通过以下步骤获得：1）引物设计：选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQIDNO.1，具体为：actcgtataatggctgatgaggaggatccatggggtttcgatgagggtgatagtgagccagccgctgcccctgctcctgccgctgccgctgccgcagatgcaggtgctgcccctgccgcgggtggtggtgagagcgccccaacaggaggcgaaactgaagcagctgccgccgaagaagaatcggcaccaccaccaccgccgccagaagacgatgggtaccgaaagcccgtgcaactatatcgtcactgggtgagaccacaattcttgcagtataaatacatgtacaactacagaacaaactactatgatgacgtaattgattacttggataagaagcaagttggcgtttcaagggaaataccgcgcgcacaaacttgggctgaacgcgtgctcagaacaagcaacgccagtggacgtgaccttgactcatacacatgttcaagcaaaagggataagcatcttgttcaaactctggctgcctcgattcgtactcataattatcacaccaaagcttatattaaccaaaaatatgcaaatgttctataaataaatacaaaacctatctataaatatgaataccaactaaaaagttagttaaaattgtagtacaatttaattataaggagatgattacctaattacgttctaataaacaataaagtgggagcttgtcgctat结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因序列和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物；上、下游引物的5’端分别加入SacI和XhoI酶切位点，具体为：flightin-F：5’-CGAGCTCACTCGTATAATGGCTGATG-3’；其中：下划线为Sac酶切位点；flightin-R：5’-CCTCGAGATAGCGACAAGCTCCCAC-3’；其中：下划线为Xho酶切位点；egfp-F：5’-CGAGCTCACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；其中：下划线为Sac酶切位点；egfp-R：5’-CCTCGAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’；其中：下划线为Xho酶切位点；2）flightin基因及对照egfp基因片段的克隆：以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板，通过PCR扩增，PCR扩增体系为TSINGKEMasterMixDNAPolymerase12.5μl，上下游引物和模板各1μl，加灭菌ddH2O至总体积25μl，扩增条件为95℃预变性3min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min，产物回收，得到含Sac和Xho酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段；3）构建桔小实蝇RNAi干扰表达载体：将含Sac和Xho酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段和L4440载体经Sac和Xho双酶切后进行酶切产物回收，用T4连接酶将回收的L4440载体分别与flightin、egfp基因片段以1:3比例室温连接10min，连接产物命名为L4440-flightin、L4440-egfp，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化的感受态细胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固体LB平板培养基上，37℃过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中培养，获得重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp作为桔小实蝇dsRNA细菌表达载体；4）重组质粒转化大肠杆菌HT115：用热激法将L4440-flightin和L4440-egfp表达载体转入CaCl2法制备的HT115感受态细胞中，涂布于含50μgmlAmp和12.5μgmlTet的LB固体培养基上，过夜培养后挑取单菌落接种到Amp和Tet抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得菌液；5）dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达：1：25比例将菌液转入新的LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌液OD600=0.4左右，加入IPTG终浓度至1.0mmolL进行诱导表达，诱导培养4h后收集菌液，采用TRIzol法提取细菌总RNA，DNaseI和RNaseA溶液消化纯化总RNA，获得表达flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的细菌菌液。

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