申请/专利权人：浙江工业大学

申请日：2022-04-13

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN114657116B

主分类号：C12N5/00

分类号：C12N5/00;A61K47/69;A61K47/62;A61K47/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2022.07.12#实质审查的生效;2022.06.24#公开

摘要：本发明公开了一种噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰方法，它通过氧化唾液酸的邻二醇基，将醛基引入细胞表面并作为与1,2‑氨基硫醇发生反应的特异位点，从而在生物兼容的条件下成功将携带该1,2‑氨基硫醇化学官能团的不同功能分子偶联到细胞表面，为制备酶‑细胞偶联物和调控细胞间特异相互作用研究提供了新方法。同时，本发明还提供了在活细胞界面上实现可控、可逆的化学修饰技术，切断细胞表面上形成的噻唑烷基。因此，本发明不仅拓展了噻唑烷形成化学在生物医学研究中的应用范围，还进一步丰富了现有细胞表面化学修饰的工具箱，从而为肿瘤免疫治疗、干细胞治疗、组织再生工程以及活细胞药物递送等研究提供了新工具。

主权项：1.一种噻唑烷形成化学介导的活细胞表面多功能化修饰方法，其特征在于，利用高碘酸钠氧化唾液酸的邻二醇基生成活性醛基的机理，在含有唾液酸的活细胞体系中添加终浓度为10mM的高碘酸钠溶液进行反应，在4℃反应10min，利用PBS清洗3-5次去除高碘酸钠，从而在含有唾液酸的活细胞表面引入活性醛基，之后利用活性醛基与1,2-氨基硫醇能够发生特异缩合反应生成噻唑烷的机理，在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子进行反应，从而将携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子以稳定共价键的形式偶联至细胞表面，从而赋予了细胞新的性质或功能；当所述活细胞为Hela细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的荧光肽，反应的条件为：在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的荧光肽，在4℃下反应10min，利用PBS清洗细胞去掉未反应的功能分子；或所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase的组合，反应的条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase；当所述活细胞为MCF-7或A549细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的GFP的组合；反应条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的GFP，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFP；当所述活细胞为THP-1细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11，反应条件为：在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11，在4℃下反应30min，用PBS清洗去除未反应的携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11；或所述1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的anti-EGFRAffibody的组合，反应条件为先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的anti-EGFRAffibody，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFPanti-EGFRAffibody；或所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag与融合有SpyCatcher的SnoopCatcher的组合，反应条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中分别添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag，分别在4℃下反应30min，利用PBS分别清洗去除未反应的携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag，然后将上述细胞混合，加入融合有SpyCatcher的SnoopCatcher，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的SnoopCatcher。

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百度查询： 浙江工业大学 一种噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰方法

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