申请/专利权人：中国医学科学院医学生物学研究所

申请日：2019-03-19

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN109750052B

主分类号：C12N15/53

分类号：C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10

优先权：["20181212 CN 2018115200051"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2019.06.07#实质审查的生效;2019.05.14#公开

摘要：本发明涉及树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列及应用，属于分子生物技术领域。通过以近源物种人类及猕猴的XDHXO基因的CDS序列保守区设计多对引物，通过RT‑PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得树鼩XDHXO基因的全长表达序列，其cDNA的全长序列5270bp，含3675bp的最大开放式阅读框架，编码了1215个氨基酸。本发明基因在用于实时荧光RT‑PCR检测了该基因mRNA在树鼩的心、肝、脾脏、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑及卵巢睾丸等不同组织中的表达丰度及差异，实现了检测树鼩体内尿酸代谢重要基因XDHXO表达丰度及差异的应用研究。

主权项：1.树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA的全长序列5270bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1，含有36754bp的最大开放式阅读框架，编码了1215个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；克隆方法包括如下步骤：步骤（1），对从树鼩样本中提取的总RNA进行反转录制备cDNA；步骤（2），以步骤（1）中获得的cDNA为模板，采用如SEQIDNO.3~SEQIDNO.18所示的8对引物进行PCR扩增；步骤（3），在对步骤（2）中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序和拼接；步骤（4），将步骤（1）中所获得的RNA作为模板，分别以SEQIDNO.19所示引物3’adaptor和SEQIDNO.24所示引物RC335-RT1，分别合成3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链，分别作为3’-RACE和5’-RACE反应的模板；步骤（5），根据步骤（3）中所获得的基因序列设计3’-RACE和5’-RACE巢式PCR的引物，然后分别以步骤（4）中所获得的3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链为模板，进行3’-RACE和5’-RACE巢式PCR扩增树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因的全长序列；3’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.20~SEQIDNO.23所示；其中，以SEQIDNO.20、SEQIDNO.22所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.21、SEQIDNO.23所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增；5’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.25~SEQIDNO.28所示；其中，以SEQIDNO.27、SEQIDNO.25所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.28、SEQIDNO.26所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增；步骤（6），对步骤（5）中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序；步骤（7），将步骤（3）中获得的序列与步骤（6）中获得的序列进行拼接，得到树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA全长序列。

全文数据：树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列及应用技术领域本发明属于分子生物技术领域，具体涉及树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列及应用。背景技术树鼩Tupaiabelangeri，treeshrews的分类地位介于灵长目与食虫目之间，其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物更与人类接近，解剖结构也更近似于人类，因此其作为较理想的实验动物在生物学研究中广泛应用。然而树鼩的遗传背景存在大量的未被确认及鉴定的遗传信息，在GenBank数据库中收录的完全测序的树鼩基因非常有限，只有少数树鼩基因被完全测序。缺乏遗传背景信息是树鼩成为人类疾病研究的实验动物的极大障碍。黄嘌呤脱氢酶氧化酶xanthinedehydrogenaseoxidase，XDHXO是一种非特异性需氧脱氢酶，在嘌呤代谢过程中催化嘌呤代谢的最后两步，从黄嘌呤和次黄嘌呤形成尿酸代谢产物终产物尿酸，在尿酸的代谢过程中发挥着重要的作用，是体内尿酸代谢中一种非常重要的酶。尿酸是人体内嘌呤代谢的最终产物，主要由黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO作用产生，并通过肾脏排出，当尿酸代谢紊乱就会造成尿酸沉积，形成高尿酸血症HUA，高尿酸血症是痛风的发病基础，其还与糖尿病、高血压、代谢紊乱综合征、胰岛素抵抗综合症等疾病有密切的关系。高尿酸血症致病机理及药物开发的研究离不开动物模型的开发及建立，目前常用的动物模型主要为大、小鼠，但大、小鼠在分类地位与人类相去甚远，所建立的尿酸代谢异常的动物模型参考性有限。之前的研究已经表明树鼩较大、小鼠更合适制作高尿酸血症动物模型，已经成功的用氧嗪酸钾给药建立了树鼩高尿酸血症动物模型。但是到目前为止还没有检索到作为尿酸代谢中的重要基因黄嘌呤氧化脱氢酶基因cDNA全长序列及其不同组织表达差异的文献报道，NCBI上可查阅到仅对树鼩XDH基因的cDNA的计算机预测的cDNA序列。因此如何克服现有技术的不足是目前分子生物技术领域亟需解决的问题。发明内容本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列及应用，通过以近源物种人类及猕猴的XDHXO基因的CDS序列保守区设计多对引物，通过RT-PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得树鼩XDHXO基因的全长表达序列。该树鼩肝脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶基因cDNA的全长序列5270bp，含3675bp的最大开放式阅读框架，编码了1215个氨基酸，分子量MW＝134321Da。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因，树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA的全长序列5270bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1，含有36754bp的最大开放式阅读框架，编码了1215个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明同时提供上述树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，对从树鼩样本中提取的总RNA进行反转录制备cDNA；步骤2，以步骤1中获得的cDNA为模板，采用如SEQIDNO.3～SEQIDNO.18所示的8对引物进行PCR扩增；步骤3，在对步骤2中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序和拼接；步骤4，将步骤1中所获得的RNA作为模板，分别以SEQIDNO.19所示引物3’adaptor和SEQIDNO.24所示引物RC335-RT1，分别合成3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链，分别作为3’-RACE和5’-RACE反应的模板；步骤5，根据步骤3中所获得的基因序列设计3’-RACE和5’-RACE巢式PCR的引物，然后分别以步骤4中所获得的3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链为模板，进行3’-RACE和5’-RACE巢式PCR扩增树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因的全长序列；步骤6，对步骤5中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序；步骤7，将步骤3中获得的序列与步骤6中获得的序列进行拼接，得到树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA全长序列。进一步，优选的是，步骤2中PCR反应体系为：PremixTaq12.5μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μL；cDNA模板2μL；去离子水8.5μL；总计25μL。进一步，优选的是，步骤2中SEQIDNO.3～SEQIDNO.125对引物的PCR反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s、55℃退火30s，共30个循环；72℃延伸7min。进一步，优选的是，步骤2中SEQIDNO.13～SEQIDNO.183对引物的PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，共33个循环；72℃延伸7min。进一步，优选的是，3’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.20～SEQIDNO.23所示；其中，以SEQIDNO.20、SEQIDNO.22所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.21、SEQIDNO.23所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增。进一步，优选的是，第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5μL；正向引物10μmolL0.5μL；反向引物10μmolL0.5μl；3’端的cDNA第一链为模板1μL；dNTP2.5mM4μL；去离子水6.3μL；Taq酶5Uμl0.2μL；总计25μL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min；第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μl；第一轮PCR扩增产物为模板1μL；dNTP2.5mM8μL；去离子水12.5μL；Taq酶5Uμl0.5μL；总计50μL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火58s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。进一步，优选的是，5’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.25～SEQIDNO.28所示；其中，以SEQIDNO.27、SEQIDNO.25所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.28、SEQIDNO.26所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增。进一步，优选的是，第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5μL；正向引物10μmolL0.5μL；反向引物10μmolL0.5μl；5’端的cDNA第一链为模板1μL；dNTP2.5mM4μL；去离子水6.3μL；Taq酶5Uμl0.2μL；总计25μL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μl；第一轮PCR扩增产物为模板1μL；dNTP2.5mM8μL；去离子水12.5μL；Taq酶5Uμl0.5μL；总计50μL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火68s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。本发明还提供上述树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因作为制备检测树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因表达丰度的试剂盒中的应用。本发明树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列在用于实时荧光RT-PCR检测了该基因mRNA在树鼩的心、肝、脾脏、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑及卵巢睾丸等不同组织中的表达丰度及差异，实现了检测树鼩体内尿酸代谢重要基因XDHXO表达丰度及差异的应用研究。实验结果显示：XDHXO在树鼩肾脏、小肠和肝脏组织中均有较高的表达，其中在肾脏组织表达最高，其余组织表达量较低。顺序由高到低依次为肾脏、小肠、肝脏、胃、皮肤、脾、卵巢、肺、肌肉、大脑、心脏。与文献报道的其他物种在不同组织中的表达丰度有较大差异，本发明为黄嘌呤氧化脱氢酶在树鼩体内的功能研究提供分子基础。本发明首次通过参考NCBI基因库中树鼩的近源物种人类及猕猴的XDHXO序列，进行引物设计，对树鼩的新鲜肝脏组织提取RNA，反转录及PCR扩增，获得目的片段，对所获得的目的片段进行克隆及测序，结合RACE技术最终得到树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶cDNA全长序列，以获得树鼩XDHXO基因完整编码序列用于实时荧光定量技术来检测树鼩不同组织黄嘌呤氧化脱氢酶mRNA表达差异及表达丰度，为研究黄嘌呤氧化脱氢酶在树鼩体内表达的组织差异及该基因的功能提供分子基础及基础生物学数据。本发明与现有技术相比，其有益效果为：1本发明获得的黄嘌呤氧化脱氢酶的基因序列是一种新的XDHXO基因序列，使人们对XDHXO基因的研究对象从大、小鼠等常用实验动物进一步扩展到分类地位高于啮齿类，犬类的新型实验动物树鼩，对于开发实验动物树鼩用于高尿酸代谢异常及XDHXO基因在树鼩体内的功能提供遗产背景等生物学数据。2本基因的获得不仅为研究树鼩的黄嘌呤氧化脱氢酶的基因表达的调控机理以及树鼩体内的功能及尿酸代谢关系奠定基础，而且通过基因序列进一步研究树鼩的黄嘌呤氧化脱氢酶功能奠定理论基础。3本发明为使用树鼩来研究高尿酸血症动物模型的建立及疾病机理中黄嘌呤氧化脱氢酶在体内的功能研究提供分子基础。利用实时荧光定量PCR方法，检测了该基因mRNA在树鼩的心、肝、脾脏、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑以及卵巢睾丸等不同组织中的表达丰度及差异，结果表明，XDHXO在树鼩肾脏、小肠和肝脏组织中均有较高的表达，其中在肾脏组织表达最高，其余组织表达量较低。顺序由高到低依次为肾脏、小肠、肝脏、胃、皮肤、脾、卵巢、肺、肌肉、大脑、心脏。与文献报道的其他物种的黄嘌呤氧化脱氢酶在不同组织中的表达丰度有较大差异，因此本发明提出树鼩在尿酸代谢过程中XDHXO的组织表达存在丰度与其他物种的差异，为利用树鼩研究来研究高尿酸血症动物模型的建立及疾病机理中黄嘌呤氧化脱氢酶在体内的功能研究提供分子基础。附图说明图1为来源于树鼩不同组织所获得的RNA完整性测定的琼脂糖凝胶电泳：其中：1.肾；2.胃；3.皮肤；4.小肠；5.肺；6.大脑；7.脾；8.卵巢睾丸；9.肌肉；10.肝；11.心；图2为树鼩XDHXO基因3'RACE端片段，1为预期片段224bp；图3为树鼩XDHXO基因5'RACE端片段，1为预期片段519bp；图4为8个中间片段含GAP及3'RAce及5'RACE端序列拼接结果；图5为树鼩XDHXO基因及内参基因GAPDH实时荧光RT-PCR溶解曲线，其中，1为GAPDH，2为XDHXO；图6为树鼩XDHXO内参基因GAPDH实时荧光RT-PCR扩增曲线，其中，1为GAPDH，2为XDHXO；图7为该基因mRNA在树鼩的心、肝、脾脏、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑以及卵巢睾丸等不同组织中的表达丰度及差异的相对表达量。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本发明除非另有说明，否则百分号为质量百分数。1、本实施例中所使用的实验动物：树鼩来源于中国医学科学院医学生物学研究所，中缅树鼩滇西亚种，普通级别饲养，饲养环境温度20℃～25℃，湿度40％～70％，正常饲喂，常规统一的蒸糕饲料饲喂，自由饮水。体重为110-150g，1～3岁龄，雌性3只，雄性2只，实验动物使用合格证号：SCXK滇K2013-00010。动物实验由中国医学科学院医学生物研究所动物实验伦理委员会审批，批准编号为：DWS2017058。2、主要仪器与耗材CFX96TMReal-TimeSystemC1000TMThermalCycler美国bio-rad公司产品，Sigma高速冷冻离心机，Sartoyius公司精密电子天平ME235S；美国bio-rad公司凝胶成像分析系统；美国bio-rad公司PCR仪；美国bio-rad公司PowerPacBasic电泳仪；日本Tomy公司SS-325高压蒸气灭菌箱；美国DanoDrop公司ND-1000紫外分光光度计。1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL的Gilson移液枪；2mLEP管、500μLEP管；1000μL吸头、200μL吸头、10μL吸头。引物设计软件：PrimerPremier5.0。3、RNA抽提试剂及cDNA合成试剂及PCR试剂逆转录试剂盒PrimeScriptTMRTReagentKitPerfectRealTime，TAKARA公司；RT-PCR酶GoTaqGreenMasterMix2X，TAKARA公司；实时荧光酶SYBRⅡPremixExTaqTMPerfectRealTime，TAKARA公司；DL2000、DL1000DNAmarker，TAKARA公司；DEPC水；RNA提取液tripure，roche公司；引物均由上海生工合成。GelRed核酸凝胶染料BIotium公司；琼脂糖IPK公司。M-MuLVFirstStrandcDNASynthesisKitM-MuLV第一链cDNA合成试剂盒B532435，LATaqTaKaRaDRR02AG、MarkerBBIB600032、6×DNALoadingDye生工；柱式DNA胶回收试剂盒生工B518131。实施例11.实验动物选择及取材从中国医学科学院小动物部树鼩动物房随机选择5只树鼩，雌性3只，雄性2只，年龄约1-2岁，体重在120-150g之间，以颈椎脱臼法处死，并迅速采集肝组织约0.1g于1.5mlEP管中，加入1mlRNA提取液tripure，置于-80℃冰箱保存备用。2.总RNA的提取在室温下将上一步所得到的组织解冻后置于高通量组织粉碎机60Hz粉碎300秒，取出静置5min；再将其转移至另一只1.5mlEP管中静置5min，加入200ul-20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min；后4℃、12000rm离心25min，吸取上清液450ul于另一只1.5mlEP管中；等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min；4℃、12000rm离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1ml-20℃预冷的75％乙醇洗涤沉淀；4℃、7500rm离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30ulDEPC水溶解沉淀。所提取的总RNA样品取1ul经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值。测定浓度后加DEPC水稀释至1000ngul，放入-80℃冰箱备用。3.RNA完整性检测及浓度测定取上述步骤所提取的总RNA样品2μl与1μL6×loadingbuffer混合均匀进行1.5％琼脂糖凝胶电泳120V，400mA20min，在凝胶成像系统下观察28S、18S和5S条带亮度，分析RNA的完整性。结果可观察到见28S、18S、5S三条带，见图1的电泳泳道10所示，说明所提取的总RNA无降解且完整性好，可进一步用于后续实验。所提取的总RNA样品经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定，以确定反转录时所需的添加量，各组样品A260A280nm值为1.95均介于1.8～2.0之间时，说明纯度较高。4.中间片段的克隆及测序4.1cDNA第一链合成按Roche公司TranscriptorFirstStrandcDNA说明书04897030001逆转录；具体步骤如下：取RNA液，用DEPC水稀释至1000ngul，按Roche第一链cDNA合成试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作，如表1、2所示。表1RNA逆转录第1步成分体积μl总RNA1μlAnchored-oligodT18Primer1μlRandomHexamerPrimer2μlWater，PCR-grade9μl使总体积为13μl，在65℃条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性，后立即将反应管置于冰上冷却。在含有模板-引物混合物的试管中加入表2中其余的RT反应液组分。表2RNA逆转录第2步成分体积TranscriptorReverseTranscriptaseReactionBuffer，5×4μlProtectorRNaseInhibitor0.5μlDeoxynucleotideMix2μlTranscriptorRerverseTranscriptase0.5μl最终体积为20μl，在反应管中将试剂小心混匀，最后在PCR仪内反应，其程序如下：25℃下10min，55℃下30min，85℃下5min，4℃∞。将逆转录产物cDNA在-30℃保存，备用。逆转录合成得到树鼩肝脏组织cDNA第一链，作为下列PCR扩增的cDNA模板。4.2目的基因引物的设计根据NCBI基因库中树鼩近缘人类及猕猴，利用引物设计软件PimerExpress5.0分别进行引物设计，设计了8对中间片段引物含gap补齐的区域。引物经生工生物工程上海股份有限公司合成，纯化方式均为HAP。正向引物1：catggctctcagtgtggattctgcaSEQIDNO.3；反向引物1：gagaggcctgcttgaatgctgagaaSEQIDNO.4；正向引物2：tgaccctcgtgtccagaggcacSEQIDNO.5；反向引物2：gtcagtgaccacagcaccaatgatgSEQIDNO.6；正向引物3：ctgtgtattgtgatgacatccctcgctacSEQIDNO.7；反向引物3：ccgagtatggtactgagaacttgctagacSEQIDNO.8；正向引物4：cactttaaccagaggcttgaggggtSEQIDNO.9；反向引物4：tacacgtgaattagggctcctgSEQIDNO.10；正向引物5：gattgtgtataattcctaccaagtttgSEQIDNO.11；反向引物5：tggttccccgacagccttSEQIDNO.12；正向引物6：cactttaaccagaggcttgaggggtSEQIDNO.13；反向引物6：gaccagggtctacagttttccggtgSEQIDNO.14；正向引物7：ttccagctagacagccctgcSEQIDNO.15；反向引物7：caatgagccaaaggtggttagaSEQIDNO.16；正向引物8：cctctaaccacctttggctcatSEQIDNO.17；反向引物8：attccagctcaaacctttcgtSEQIDNO.18。扩增、产物回收、纯化、克隆及测序4.3.1PCR反应由于该基因较长，所以本发明分为8段区域含gap补齐的区域进行扩增，以前述所得的cDNA第一链作为模板，利用上述8对正向引物和反向引物进行XDHXO基因中间片段含gap补齐的区域的扩增，分别在下列PCR扩增体系下：25μL体系，PremixTaq12.5μL，10μmolL正向、反向引物各1μL，cDNA模板2μL，8.5μL去离子水，进行下列PCR扩增：其中对引物1、引物2、引物3，引物4，引物5分别扩增，条件程序参数经优化可优选为：第1步98℃预变性10min；第2步98℃变性10s、55℃退火30s，第2步共30个循环，第3步72℃延伸7min。其中对引物6、引物7、引物8：分别扩增条件程序参数经优化均可优选为第1步95℃预变性3min；第2步94℃变性30s、55℃退火30s，第2步共33个循环，第3步72℃延伸7min。取扩增产物10μl，分别经1％的琼脂糖凝胶，核酸凝胶染料染色后凝胶成像仪检测目的片段，结果所得到的片段与设计的预期片段一致。产物回收、纯化、克隆及测序及拼接将PCR产物编号，委托通用生物系统安徽有限公司对上述PCR产物分别进行产物的回收，纯化，pMD18-T载体克隆，每个产物挑取6个克隆进行双向测序，确保至少3个克隆测序结果的一致性。将所获得的中间片段进行序列拼接：利用DNAMA软件的SequenceAssembly进行上述中间片段的序列拼接，预先得到拼接后中间片段的DNA序列。测序结果所得序列在Blastn进行比多分析，验证克隆片段是否正确。中间片段1T1daH.seq，长度952bp，序列如SEQIDNO.29。中间片段2T2-A10.seq，长度952bp，序列如SEQIDNO.30。中间片段3T3.Seq，长度1222bp，序列如SEQIDNO.31。中间片段4T4.seq，长度212bp，序列如SEQIDNO.32。中间片段5GAP-4.seq，796bp，序列如SEQIDNO.33。中间片段6T4-XIAO.seq，338bp，序列如SEQIDNO.34。中间片段7GAP-5.seq，长度581bp，序列如SEQIDNO.35。中间片段8GAP-6.seq，长度390bp，序列如SEQIDNO.36。实施例23’端的克隆测序：1.引物设计根据上述步骤得到的中间片段序列，设计并合成用于3'端巢式PCR的两个正向引物以及通用性反向引物，分别为:1.1通用反转录引物：3’adaptor：gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgttttttttttttttttttSEQIDNO.19；1.2巢式PCR正向特异性引物：RC424-F7：acgaaaggtttgagctggaatgatatctaagaSEQIDNO.20；RC424-F8：gtgatatgtgggcctaatgaattctgcttagaSEQIDNO.21；1.3巢式PCR反向接头引物5.3’outer：gctgtcaacgatacgctacgtaacSEQIDNO.22；5.3’inner：gctacgtaacggcatgacagtgSEQIDNO.23；2.合成3’端的cDNA第一链以前述步骤实施例1中纯化得到的树鼩肝脏组织总RNA作为模板，以3’adaptor为反转引物，进行cDNA第一链合成，得到cDNA第一链，作为3’巢式PCR扩增的为模版cDNA模板，以RC424-F7、5.3’outer为正反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以RC424-F、85.3’inner为正反向引物进行第二轮PCR扩增。第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5μL；正向引物10μmolL0.5μL；反向引物10μmolL0.5μl；3’端的cDNA第一链为模板1μL；dNTP2.5mM4μL；去离子水6.3μL；Taq酶5Uμl0.2μL；总计25μL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min；第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μl；第一轮PCR扩增产物为模板1μL；dNTP2.5mM8μL；去离子水12.5μL；Taq酶5Uμl0.5μL；总计50μL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火58s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。以上扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图2与回收试剂盒，委托上海生物工程有限公司将PCR纯化产物连接到pMD18-T载体上，以pMD18-T载体上的通用引物扩PCR，对PCR产物进行克隆测序。3’端的克隆测序结果，长度为244bp，序列如SEQIDNO.37。实施例35’端的克隆测序：1.合成5’端的cDNA第一链根据上述步骤2得到的中间片段序列，设计并合成特异性反转录引物RC335-RT1：gggtccatgctgcactgagttcagttSEQIDNO.24；以特异性引物RC335-RT1进行cDNA第一链反转合成，RNaseH消化残余RNA和TdT处理后，并用末端转移酶在3'端添加polyC尾巴，得到5’端的cDNA第一链，进行巢氏PCR；2.巢氏PCR扩增根据上述步骤得到的中间片段序列，使用Primer5软件设计两个特异性反向引物，用于5'端巢式PCR：RC335-R1：gttgtccttatttcctccacagcatccaSEQIDNO.25；RC335-R2：gaaggatgggcctgtaacctgtgcaSEQIDNO.26；正向引物为通用接头引物：5’adaptor：gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgcccccccccccccccSEQIDNO.27；5.3’outer：gctgtcaacgatacgctacgtaacSEQIDNO.28。首先以正向接头引物5’adaptor和特异性反向引物RC435-R1为引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以正向接头引物5.3’outer和特异性反向引物RC435-R2为引物进行第二轮PCR扩增。以上扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图3与回收试剂盒，委托生工生物工程上海有限公司进行克隆测序。第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5μL；正向引物10μmolL0.5μL；反向引物10μmolL0.5μl；5’端的cDNA第一链为模板1μL；dNTP2.5mM4μL；去离子水6.3μL；Taq酶5Uμl0.2μL；总计25μL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μl；第一轮PCR扩增产物为模板1μL；dNTP2.5mM8μL；去离子水12.5μL；Taq酶5Uμl0.5μL；总计50μL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火68s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。5’端的克隆测序结果，长度为502bp，序列如SEQIDNO.38。实施例4XDHXO全长序列拼接将8段中间序列及RACE实验得到的序列使用DNAMAN软件包中的SequenceAssembly软件进行拼接，得到基因的全长序列，序列拼接图见图4，编辑得到的XDHXO基因全长cDNA全长序列为5270bp，其中，SEQIDNO.1中第32-3679个碱基为CDS区，拼接结果如下SEQIDNO.1，XDHXO基因的起始密码子上游有一个终止密码子TGA，距polyA尾18个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为树鼩肝脏组织XDHXO基因的全长cDNA序列。实施例5推导氨基酸序列根据所获得的黄嘌呤氧化脱氢酶基因cDNA全长序列5270bp序列，利用DNAMAN软件包ProteinTranslate翻译推导出氨基酸序列，寻找最大开放阅读框，其中最大PRF含3675bp，推测得到了其编码的1215个氨基酸及序列，分子量MW＝134321Da。氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。应用实例采用XDHXO基因序列的实时荧光RT-PCR检测树鼩不同XDHXO基因表达差异1引物设计：根据SEQIDNO1所述树鼩XDHXO的全长序列，使用Primer5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：XDHXOF：5'-tcatttccgctgatgatgttcc-3'SEQIDNO.39；XDHXOR：5'-gcaccaatgatatgccaacac-3'SEQIDNO.40；XDHXO基因的PCR产物预计长度为92bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测；根据参照文献及NCBI里提供的近缘物种猕猴macacamulattaGAPDH核苷酸序列作为参考设计用于实时荧光PCRGAPDH内参引物，引物序列如下：GAPDHF：5'-agccccatcaccatcttcc-3'SEQIDNO.41；GAPDHR：5'-aatgagccccagccttctc-3'SEQIDNO.42；GAPDH的PCR产物预计长度为112bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。2树鼩XDHXO基因实时荧光定量PCR方法的建立以DEPC水梯度稀释逆转录合成的树鼩肝脏cDNA第一链，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各取2ul做3个平行样以水为空白对照进行实时荧光定量检测，荧光定量PCR体系及反应条件如下：PCR扩增体系为25μL体系：SYBRPremixExTaqII酶2×12.5μL，cDNA模板1μL含有cDNA约500ng，XDHXOF和XDHXOR上、下游引物各1μL10μM，去离子水9.5μL；总计25μL；SYBRPremixExTaqII酶2×12.5μL，cDNA模板1μL含有cDNA约500ng，GAPDHF和GAPDHR上、下游引物各1μL10μM，去离子水9.5μL；总计25μL。反应条件：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火30s，40个循环；59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；SYBRPremixExTaqⅡ酶为TAKARA生物有限公司生产的荧光定量PCR试剂；通过上述体系及反应条件进行实时荧光定量PCR，得到XDHXO基因和GAPDH基因的溶解曲线图5及扩增曲线图6。标准曲线显示了XDH基因扩增效率为116.5％，斜率接近－2.981，R2为0.992，GAPDH基因扩增效率为115.4，斜率为－2.833，R2为0.997，目的基因及内参基因R2接近1，以上指标表明该引物及体系所建立的方法结果可信度较高，是符合实时荧光定量PCR要求。可用于下一步实验。3动物取材：从中国医学科学院实验动物部树鼩房随机选择五只健康树鼩，雌性3只，雄性2只，年龄约1-2岁，体重在120-150g之间，以颈椎脱臼法处死，并迅速采集心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑以及卵巢睾丸组织约0.1g于1.5mlEP管中，加入1mlRNA提取液tripure，置于-80℃冰箱保存备用。4总RNA提取与纯化：同实施例2。分别取每只动物取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤、胃、小肠、脑以及卵巢睾丸共11个组织的总RNA进行电泳，结果均可见明显28S、18S、5S三条带见图1，说明所提取的总RNA无降解，均可用于后续试验。5cDNA第一链合成：cDNA第一链的合成采用同实施例1中4.1。6树鼩不同XDHXO基因表达差异分析将上述11种组织所提取组织的cDNA通过上述检测体系及反应条件进行实时荧光定量PCR检测，每管重复3次，空白对照为DEPC水，同样重复3次。根据溶解曲线判断产物特异性。待反应结束后通过CFX96Real-TimeSystem软件自带公式计算相关数据，导出各组织XDHXO基因与内参基因GAPDH、无模板对照阈值循环Ct、Ct平均值、Ct标准偏差值、以零点作为数据处理的相对对照，软件分析模式测定均一化后的基因表达normalizedexpressionΔΔCq，相对表达值，见图7，结果显示，XDHXO在树鼩肾脏、小肠和肝脏组织中均有较高的表达，其中在肾脏组织表达最高，其余组织表达量较低。顺序由高到低依次为肾脏、小肠、肝脏、胃、皮肤、脾、卵巢、肺、肌肉、大脑、心脏。与文献报道的其他物种在不同组织中的表达丰度有较大差异，本发明为树鼩来研究高尿酸血症动物模型的建立及疾病机理中黄嘌呤氧化脱氢酶在体内的功能研究提供分子基础。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表中国医学科学院医学生物学研究所树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXOcDNA全长序列及应用42SIPOSequenceListing1.015270DNA人工序列1acttggagttcagggaccccaactggtgacaatgacagcagatgagtcggttttctttgt60gaatggcagaaaggtggtggagaaaaatgctgatccggaaacaactttgttggcctacct120gagaagaaagttggggctgagcgggaccaagcttggctgtggagaagggggatgcggtgc180ttgcacggtgatgctttccaagtatgatcatttccagaacaagatcgttcacttttctgc240caatgcctgcctggcccccatatgctccttgcaccatgttgctgtgacgactgtggaagg300aataggaagcaccaagtcaaggctgcatccagtgcaggagagaattgccaaaagccatgg360ctctcagtgtggattctgcacccccggcatcgtcatgagcatgtatacactgctccggaa420ccagccctcgcccaccattgaggaaattgagaatgccttccaaggaaacctctgccgctg480cacaggttacaggcccatccttcagggctttcggaccttcgcccgggatggtggatgctg540tggaggaaataaggacaacccaaactgctgcatgaaccagaagaaagaccacacacttat600tctctcaccatcattattcaaaccagaggagttcacccccctagatcccacccaggaacc660catctttcccccagagttgatgaggctgaaagacactcctcggaagcaactgcgctttga720aggggagcgtgtgacatggatccaggcctcatccctgaaggagctgctggaccttaaagc780tgagcatcctgatgccaaactggtggtggggaacacggagattggcattgagatgaagtt840taagaacatgctgttccctctgattgtctgcccagcctggatccctgaactgaactcagt900gcagcatggacccgagggtatctcctttggagctgcttgctccctgagttctgtggaaca960gatcctggttgatgcggttgctaatcttcctgtccaaaaaacagaggtgtttaggggagt1020gctggagcagatgcgttggtttgctgggaagcaggtcaagtctgtggcgtccatcggagg1080gaacatcatcaccgccagccccatctctgacctcaatcctgtgttcatggcgagtggggc1140caagctgaccctcgtgtccagaggcaccaggagaactgttcgaatggatcacaccttctt1200ccctggctacagaaagaccctgctgagcccagaggagatactgctttccatagagatccc1260ctacagcagggagggtgagtttttctcagcattcaagcaggcctctcggagagaagatga1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权利要求：1.树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因，其特征在于，树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA的全长序列5270bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1，含有36754bp的最大开放式阅读框架，编码了1215个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），对从树鼩样本中提取的总RNA进行反转录制备cDNA；步骤（2），以步骤（1）中获得的cDNA为模板，采用如SEQIDNO.3~SEQIDNO.18所示的8对引物进行PCR扩增；步骤（3），在对步骤（2）中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序和拼接；步骤（4），将步骤（1）中所获得的RNA作为模板，分别以SEQIDNO.19所示引物3’adaptor和SEQIDNO.24所示引物RC335-RT1，分别合成3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链，分别作为3’-RACE和5’-RACE反应的模板；步骤（5），根据步骤（3）中所获得的基因序列设计3’-RACE和5’-RACE巢式PCR的引物，然后分别以步骤（4）中所获得的3’端的cDNA第一链和5’端的cDNA第一链为模板，进行3’-RACE和5’-RACE巢式PCR扩增树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因的全长序列；步骤（6），对步骤（5）中扩增所得的PCR产物进行回收、纯化、克隆，以及测序；步骤（7），将步骤（3）中获得的序列与步骤（6）中获得的序列进行拼接，得到树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因cDNA全长序列。3.根据权利要求2所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤（2）中PCR反应体系为：PremixTaq12.5μL；正向引物10μmolL1μL；反向引物10μmolL1μL；cDNA模板2μL；去离子水8.5μL；总计25μL。4.根据权利要求2所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤（2）中SEQIDNO.3~SEQIDNO.125对引物的PCR反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s、55℃退火30s，共30个循环；72℃延伸7min。5.根据权利要求2所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤（2）中SEQIDNO.13~SEQIDNO.183对引物的PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，共33个循环；72℃延伸7min。6.根据权利要求2所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，3’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.20~SEQIDNO.23所示；其中，以SEQIDNO.20、SEQIDNO.22所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.21、SEQIDNO.23所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增。7.根据权利要求6所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5µL；正向引物10μmolL0.5µL；反向引物10μmolL0.5µl；3’端的cDNA第一链为模板1µL；dNTP2.5mM4µL；去离子水6.3µL；Taq酶5Uμl0.2µL；总计25µL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min；第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25µL；正向引物10μmolL1µL；反向引物10μmolL1µl；第一轮PCR扩增产物为模板1µL；dNTP2.5mM8µL；去离子水12.5µL；Taq酶5Uμl0.5µL；总计50µL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火58s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。8.根据权利要求2所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，5’-RACE巢式PCR扩增所采用的引物如SEQIDNO.25~SEQIDNO.28所示；其中，以SEQIDNO.27、SEQIDNO.25所示引物作为正、反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以SEQIDNO.28、SEQIDNO.26所示引物为正、反向引物进行第二轮PCR扩增。9.根据权利要求8所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，第一轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI12.5µL；正向引物10μmolL0.5µL；反向引物10μmolL0.5µl；5’端的cDNA第一链为模板1µL；dNTP2.5mM4µL；去离子水6.3µL；Taq酶5Uμl0.2µL；总计25µL；第一轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火30s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。第二轮PCR扩增体系为：2×GCBufferI25µL；正向引物10μmolL1µL；反向引物10μmolL1µl；第一轮PCR扩增产物为模板1µL；dNTP2.5mM8µL；去离子水12.5µL；Taq酶5Uμl0.5µL；总计50µL；第二轮PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、68℃退火68s，72℃延伸60S，共33个循环；72℃延伸7min。10.权利要求1所述的树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因作为制备检测树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDHXO基因表达丰度的试剂盒中的应用。

百度查询： 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDH/XO cDNA全长序列及应用

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