申请/专利权人：厦门承葛生物科技有限公司

申请日：2023-12-22

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117737106A

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N1/21;C12N15/60;C12N15/31;C12R1/19

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.09#实质审查的生效;2024.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法，该方法以EscherichiacoliNissle1917EcN为底盘进行改造，利用CRISPRCas9双质粒系统pEcCaspEcgRNA，将组成型启动子P32、来源于多变鱼腥藻Anabaenavariabilis并进行了密码子优化的苯丙氨酸解氨酶基因AvPAL整合到EcN染色体，构建能表达苯丙氨酸解氨酶、降解苯丙氨酸、无抗性标记的遗传工程菌株EcN‑AvPAL。本发明改造后的工程菌能有效表达重组苯丙氨酸解氨酶，具有优良的降解苯丙氨酸活性，同时不影响菌株的生长活性，为苯丙酮尿症治疗活菌药物的研发提供了一条新途径。

主权项：1.一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1，pEcgRNA-N20-AvPAL载体构建；通过重叠PCR获得AvPAL表达框，重叠PCR获得AvPAL表达框及双酶切得到酶切载体pEcgRNA-N20；然后，进行pEcgRNA-N20-AvPAL载体构建；通过大肠杆菌CRISPR-Cas9系统pEcgRNApEcCas将苯丙氨酸解氨酶基因表达盒AvPAL敲入EcN基因组中，通过T4连接构建pEcgRNA-N20载体；再对pEcgRNA-N20载体进行酶切，连接pEcgRNA-N20酶切载体和AvPAL表达框up-P32-AvPAL-T1-down，转化DH5α感受态，构建pEcgRNA-N20-AvPAL载体；然后使用2xTaqPCRMasterMix进行扩增，引物为FV和RV；步骤2，EcN-AvPAL菌株构建；将pEcgRNA-N20-AvPAL质粒转化EcN感受态细胞进行CRISPR基因插入；步骤3，EcN-Δpal-AvPAL菌株构建；先进行EcN-Δpal菌株构建，再进行EcN-Δpal-AvPAL菌株构建。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 厦门承葛生物科技有限公司 一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法

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