申请/专利权人：深圳市茵冠生物科技有限公司

申请日：2022-03-30

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN114591902B

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775;C12N5/073

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2022.06.24#实质审查的生效;2022.06.07#公开

摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及应用。所述间充质干细胞的培养方法，包括间充质干细胞原代细胞的提取、间充质干细胞原代细胞的培养扩增以及间充质干细胞的分离等步骤。本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法，生产成本低，过程简单，易于操作，培养出来的干细胞可用于生产组织和细胞。

主权项：1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、间充质干细胞原代细胞的提取；S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增；S3、间充质干细胞的分离；所述步骤S2具体为：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60-80%时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入胰蛋白酶消化，细胞收缩变圆后加入上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液离心，弃掉上清液，用PBS离心漂洗，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1-1.5接种至细胞培养皿中，于30-40℃、4-7%CO2及饱和湿度条件下进行培养2-6天后，细胞融合65-75%时以1：5-8的比例传代至细胞培养皿中；所述无血清培养基，包括DMEMF12培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，所述无血清培养基还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂为芒果叶提取物和改性虾青素的混合物，其中芒果叶提取物和改性虾青素的质量比为1:（2-5）；所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后粉碎，然后用65-75wt%乙醇水溶液按料液比1g:（15-30）mL在温度65-75℃下超声提取60-120min，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物；所述改性虾青素的制备方法如下：L1、在室温下，将4-8重量份甲氧基聚乙二醇与20-30重量份ε-己内酯混合超声8-12min，然后加入0.1-0.2重量份催化剂，继续超声3-7min，然后放入温度120-150℃的油浴中，通入氮气并搅拌反应18-30h，结束后冷却至室温，加入20-30重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入80-120重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；L2、将5-8重量份上述改性共聚物溶于8-15重量份丙酮中，再加入2-5重量份虾青素超声4-8min，得到混合液，然后将混合液加入40-60重量份水中搅拌10-30min，随后旋蒸、过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。

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