申请/专利权人：豪夫迈·罗氏有限公司

申请日：2020-06-17

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN114080451B

主分类号：C12N5/10

分类号：C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90;C07K16/00;C07K16/46

优先权：["20190619 EP 19181099.3"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2022.03.11#实质审查的生效;2022.02.22#公开

摘要：本文报告了一种用于产生包含编码多肽的脱氧核糖核酸并且分泌所述多肽的重组哺乳动物细胞的方法，该方法包括以下步骤a提供包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞，所述外源核苷酸序列整合在所述哺乳动物细胞的基因组的基因座内的单个位点处，其中所述外源核苷酸序列包括侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于所述第一重组识别序列与所述第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有重组识别序列都不同；b向a中所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列以及一至八个表达盒，其中第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含第一重组识别序列、一个或多个表达盒、编码一个第二选择标志物的表达盒的5’末端部分以及第三重组识别序列的第一拷贝，并且第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含所述第三重组识别序列的第二拷贝、编码所述一个第二选择标志物的表达盒的3’末端部分、一个或多个表达盒以及第二重组识别序列，其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的第一重组识别序列至第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列至第三重组识别序列匹配，其中编码所述一个第二选择标志物的所述表达盒的所述5’末端部分和所述3’末端部分在合在一起时形成所述一个第二选择标志物的功能性表达盒；c引入Cre重组酶mRNA，以及d选择表达所述第二选择标志物并且分泌所述多肽的细胞，从而产生包含编码所述多肽的脱氧核糖核酸并且分泌所述多肽的重组哺乳动物细胞，其中所述Cre重组酶mRNA是所述方法中Cre重组酶的唯一来源。

主权项：1.一种用于产生包含编码多肽的脱氧核糖核酸并且分泌所述多肽的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a提供包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞，所述外源核苷酸序列整合在所述哺乳动物细胞的基因组的基因座内的单个位点处，其中所述外源核苷酸序列包括侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于所述第一重组识别序列与所述第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有重组识别序列都不同，其中所述哺乳动物细胞不含Cre重组酶编码DNA；b向a中所提供的细胞中转化两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列以及一至八个表达盒，其中第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含-第一重组识别序列，-一个或多个表达盒，-编码一个第二选择标志物的表达盒的5’末端部分，以及-第三重组识别序列的第一拷贝，并且第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含-所述第三重组识别序列的第二拷贝，-编码所述一个第二选择标志物的表达盒的3’末端部分，-一个或多个表达盒，以及-第二重组识别序列，其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述第一重组识别序列至所述第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列至所述第三重组识别序列匹配，其中编码所述一个第二选择标志物的所述表达盒的所述5’末端部分和所述3’末端部分在合在一起时形成所述一个第二选择标志物的功能性表达盒，其中所述脱氧核糖核酸不含Cre重组酶编码DNA；c与b的所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸同时转化Cre重组酶mRNA作为Cre重组酶的唯一来源，其中所述Cre重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列；并且任选地其中一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换；并且d选择表达所述第二选择标志物并且分泌所述多肽的细胞，从而产生包含编码所述多肽的脱氧核糖核酸并且分泌所述多肽的重组哺乳动物细胞；其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用Cre mRNA进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法

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