申请/专利权人：中国人民解放军陆军军医大学

申请日：2019-04-19

公开（公告）日：2024-03-26

公开（公告）号：CN110272900B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/90;A01K67/0275

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.26#授权;2019.10.22#实质审查的生效;2019.09.24#公开

摘要：本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用。本发明要解决的是现有的鼠骨骼发育异常动物模型和人类在骨骼结构、功能方面均有较大差异的技术问题。本发明技术手段是提供一种制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA。该sgRNA识别位于猪成纤维细胞生长因子受体3编辑基因上的核苷酸序列为5’‑GAAAGCCCAGCCCGTAGCTGAGG‑3’的靶位点。在获得上述sgRNA基础上，设计配合的供体DNA，能高效制备Fgfr3c.1132GA精准突变猪模型，培育软骨发育异常的FGFR3p.G378R突变猪系，为骨骼发育研究及骨骼疾病的临床治疗提供与人更接近的大动物模型。

主权项：1.制备骨骼发育异常猪模型的试剂盒，包括以下成分：制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA、与所述sgRNA配合使用的供体DNA以及编码spCas9蛋白的mRNA和或spCas9重组蛋白；其中，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示；所述供体DNA的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示或为SEQIDNO.5的互补序列。

全文数据：用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用技术领域本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及一种用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用。背景技术骨骼是发育畸形、遗传疾病种类最多的器官之一，目前在线人类孟德尔遗传病数据库OMIM已收录单基因骨骼遗传病有400余种。常见骨骼发育畸形包括侏儒、脊柱发育不良、成骨不全、颅面畸形、遗传性骨代谢疾病骨硬化、佝偻病等。目前，用于骨骼发育性疾病研究最常用的动物模型为基因工程小鼠，其作为模式动物围绕骨骼发育、代谢疾病开展了较多研究。但小鼠属于啮齿类动物，其与人类在骨骼结构、功能方面均有较大差异，如小鼠骨骼无哈弗斯系统，脊柱无骨性终板，且骨骼的早期模式发育与形态建成方式不同，生长板终身不闭合等。此外，因体型小，难以实现反复采样血、尿用于代谢相关指标检测、力学性能测定及手术操作如矫形手术、支局及组织工程材料植入等。猪，尤其是小型猪，在体重、骨骼的解剖、组织结构骨小梁厚度、胶原排列、矿化沉积速度、关节大小与负重力学、关节软骨厚度、椎间盘的结构与组分、腰椎旋转角度等及发育过程等方面与人类基本一致。目前，猪主要被用于骨关节等运动系统损伤修复过程中生物材料、干细胞治疗及手术器械、手术方式疗效等的评估，还缺乏利用遗传修饰猪在骨骼方面的研究。Fgfr3成纤维细胞生长因子受体3是骨骼发育调控的关键分子，该分子的突变会导致骨骼发育异常。其中，可导致FGFR3蛋白第378位甘氨酸突变为精氨酸的点突变Fgfr3c.1132GA是人临床中最常见的软骨发育障碍突变，但目前尚无遗传性骨骼发育异常猪及其它大动物模型的报道。发明内容本发明要解决的技术问题是现有的鼠骨骼发育异常动物模型和人类在骨骼结构、功能方面均有较大差异的缺陷。本发明解决技术问题的技术手段是提供一种制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA。该sgRNA识别位于猪成纤维细胞生长因子受体3编码基因上的核苷酸序列为5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTGAGG-3’SEQIDNO.l的靶位点。进一步的，所述的sgRNA中识别靶位点的引导序列为：5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTG-3’SEQIDNO.2。进一步的，所述sgRNA的核苷酸序列为：5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3’SEQIDNO.3。本发明还使用了一种用于与上述的制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA配合使用，将猪的成纤维细胞生长因子受体3编码基因上编码第378位甘氨酸的密码子突变为精氨酸密码子的供体DNA。进一步的，所述的将猪的成纤维细胞生长因子受体3编码基因上编码第378位甘氨酸的密码子突变为精氨酸密码子是指猪Fgfr3c.1132GA突变。其中，所述的供体DNA为双链供体DNA或单链供体DNA。优选的，所述的供体DNA中包含以下核心序列5’-TTATA-3’SEQIDNO.4，或其互补序列。其中的，所述的供体DNA中的核心序列两侧包含50～70个碱基的同源序列。优选的，所述的供体DNA的核苷酸序列为：5’-CCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGGTGAGGCTGGCAGTGTGTACGCGGGGGTCCTCAGTTATAGGCTGGGCTTTCTCCTCTTCATCCTGGTGGTGGCCACCGTGACACTCTGCCGCCTGCGCAGCCCCCC-3’SEQIDNO.5或为其互补序列。在此基础上，本发明还提供了一种制备骨骼发育异常猪模型的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：上述的sgRNA和或上述的供体DNA。进一步的，所述试剂盒还可包括编码spCas9蛋白的mRNA和或spCas9重组蛋白。进一步的，试剂盒内的各主要成分为独立包装。本发明也提供了一种制备骨骼发育异常猪模型的方法。该方法包括以下步骤：a、将上述的sgRNA上述的供体DNA与编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；b、将步骤a处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；c、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到骨骼发育异常猪模型。其中，上述方法中所述的sgRNA、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白之间的配比例为按在混合物中的终浓度sgRNA10～15nguL、spCas9mRNA和或spCas9纯化重组蛋白20～25nguL、以及供体DNA5～10nguL。进一步的，上述方法中所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。进一步的，上述方法中所述的步骤c中还包括有检测验证步骤：使用pFgfr3-E9-F1R1表1引物扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型pFgfr3c.1132GA，若含有该基因型即表明建模成功。本发明的有益效果在于：本发明针对人软骨发育障碍最常见的突变位点Fgfr3c.1132G，首次在找到了猪Fgfr3基因的相应位点，并在附近设计了一个高效sgRNA位点，并构建一个针对该位点、能有效通过DNA“同源指导修复”homology-directedrepair,HDR机制实现Fgfr3c.1132GA突变定点敲入的供体DNA，能高效制备Fgfr3c.1132GA精准突变猪模型。实验表明，首建猪的突变效率可高达100％，其中通过HDR机制实现的FGFR3p.G378R精准突变率可高达80％。通过首建猪的横交配种，能有效培了育软骨发育异常的FGFR3p.G378R突变猪系；同时，利用本发明所采用的sgRNA位点，可有效诱导猪Fgfr3基因发生移码突变，通过首建猪的横交配种可培育Fgfr3基因发生完全敲出的突变猪，该突变猪可作为骨骼过度生长、且脊柱发生侧弯的大动物模型。本发明能高效地为骨骼发育研究及骨骼疾病的临床治疗提供与人更接近的大动物模型，具有很好的应用价值。附图说明图1实验设计方案。A，人、小鼠和猪FGFR3编码蛋白氨基酸序列比对结果，黑色方框为人FGFR3p.G380R突变同源氨基酸位点。B，猪FGFR3基因组成，同源位点位于9号外显子，下方粗箭头为sgRNA，灰色横线为ssODN模板，左侧粗箭头表示基因的转录方向。C,FGFR3-G378R-ssODN结构图。划线的A碱基为目标突变碱基pFgfr3c.1132GA；两个灰色的T碱基为两个同义突变碱基pFgfr3c.1131CT和pFgfr3c.1128CT；突变碱基两侧的黑色字母和黑线条为突变碱基两侧的同源序列。D，本发明的sgRNA此处命名为Fgfr3-G378-sgRNA和–供体DNA此处命名为Fgfr3-G378R-ssODN介导预期基因突变的工作原理图。序列下方箭头所示为sgRNA识别区域，剪刀符号所示位置为spCas9蛋白切割位点；识别序列3’末端的3个碱基AGG为PAM结构；靶基因识别位点中下划线标示的GGG碱基为编码第378位甘氨酸的密码子，其中灰色标示的G碱基为拟突变靶点；供体DNA及编辑后的基因序列中划线的碱基A为目标突变碱基，两个灰色的T碱基为同义突变碱基。图2首建猪遗传分析结果。A，编号pF1-1～pF1-5从左到右耳组织基因组扩增pFgfr3第9号外显子PCR产物凝胶电泳结果Marker100bp。B，编号pF1-1～pF1-5基因编辑位点附近序列测序分析结果，括号内：数字为含有相应基因型克隆数总有效测序克隆数；KI：预期基因敲入基因型pFgfr3c.1132GA；其它基因突变类型用国际通用的命名规则标示；“PCR产物”表示该基因型为PCR产物直接测序的结果。C，个体各基因型测序峰图，黑色方框中的碱基为基于供体DNA同源重组的预期突变位点，其中2个T碱基为同义突变碱基，A碱基为目标突变碱基Fgfr3c.1132GA；黑色箭头表示碱基缺失突变位置pFgfr3c.1124_1130delCAGCT；圆形框所示碱基为插入突变的碱基。图3Fgfr3移码突变猪和Fgfr3c.1132GA杂合突变猪的活体表型。A，出生的5头首建仔猪的照片其中白色箭头所示为含有移码突变的pF1-3个体和pF1-3个体的脊柱侧弯表型；B，Fgfr3c.1132GA杂合突变猪和野生型猪的照片。图4突变猪长骨相对长度*表示PA的DNA同源重组模板供体DNA。该供体DNA需包含以下核心序列：其中划线碱基为突变碱基，其中2个划线的T碱基为同义突变碱基，划线的A碱基为目标突变碱基。一般的，在实际使用过程中，供体DNA需要在前述的核心序列两侧设置50～70个碱基的同源序列。进一步的，本发明还优选得到了一条供体DNA命名为：Fgfr3-G378R-ssODN，其核苷酸为：其中黑色加粗的碱基序列为核心序列，2个划线的T碱基为同义突变碱基，划线的A碱基为目标突变碱基；斜体标示的碱基为同源臂序列。该供体DNA包含了可导致猪FGFR3蛋白第378位甘氨酸突变为精氨酸的Fgfr3c.1132GA突变，同时在编码猪FGFR3蛋白第377位酪氨酸和第376位丝氨酸的密码子TAC和AGC中分别导入了有2个同义碱基突变，分别为Fgfr3c.1131CT和Fgfr3c.1128CT，以抑制pFgfr3-G378-sgRNAspCas9蛋白复合体对同源重组后的突变位点进行再切割；在上述突变碱基的两侧，分别含有50～70个碱基的同源序列，以实现同源重组和突变位点的敲入。在本发明的一个实例中，利用本发明设计的pFgfr3-G378-sgRNA位点和供体DNA的基础上，本领域技术人员就能够通过CRISPRCas9的基因组编辑系统和显微注射技术，将上述的sgRNA、供体DNA与编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；再将上述处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到骨骼发育异常猪模型。其中，上述的sgRNA、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白之间的配比例为按在混合物中的终浓度sgRNA10～15nguL、spCas9mRNA和或spCas9纯化重组蛋白20～25nguL、以及供体DNA5～10nguL。进一步的，上述方法中所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。为了检测上述方法建模是否成功，还可以使用引物扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型pFgfr3c.1132GA，若含有该基因型即表明建模成功。本发明也提供了有效的检测用引物pFgfr3-E9-F1R1参见表2。在本发明的一个实例中，利用本发明设计的pFgfr3-G378-sgRNA位点和Fgfr3-G378R-ssODN模板，将相应的体外转录的sgRNA和人工合成的单链DNA模板以及spCas9mRNA通过显微注射同时导入猪1～2细胞期的受精卵中，并将注射后的受精卵移植于处于发情期的成年母猪输卵管中，高效获得了FGFR3蛋白第378位甘氨酸突变为精氨酸的突变猪FGFR3p.G378R突变猪，首建猪的突变效率可高达100％，其中通过HDR机制实现的FGFR3p.G378R精准突变率可高达80％。通过首建猪的横交配种，有效培了育软骨发育异常的FGFR3p.G378R突变猪。而利用本发明所采用的sgRNA位点，可有效诱导猪Fgfr3基因发生移码突变，通过首建猪的横交配种可培育Fgfr3基因发生完全敲出的突变猪，该突变猪可作为骨骼过度生长、且脊柱发生侧弯的大动物模型。以下通过对实施例对本发明进行更详细的说明。实施例一FGFR3p.G378R突变猪的制备一、实验方案：1、同源重组模板的制备根据设计的同源重组模板的序列，人工合成单链寡聚核苷酸ssODN,≤150bp上海生工；将合成的ssODN冻干粉用RNase-free超纯水以500nguL的浓度溶解和分装，保存于-80摄氏度备用。2、sgRNA的制备1合成两条互补的含有sgRNA识别序列的寡聚核苷酸单链DNAoligoDNA，正义链SEQIDNO.6：5-TAGGAAGCCCAGCCCGTAGCTG-3；反义链SEQIDNO.7：5-AAACCAGCTACGGGCTGGGCTT-3。两条互补单链DNA复性为双链后，末端要与sgRNA体外转录质粒上的酶切后的亚克隆位点互补；本实例所用的sgRNA体外转录质粒为pUC57kan-T7-gRNA-U6V2Addgene#115520,y，用于亚克隆的酶切位点为BsaI；2每条合成的单链oligoDNA取1OD，以0.2uguL的浓度溶解于去离子水中，并以20uL管分装后保存备用；3各取1管互补的单链oligoDNA溶液，等体积混合并充分混匀后，在含有1L自来水的水浴锅中，于95摄氏度温育10min，以使两条互补的单链oligoDNA充分变性为单链状态；4关掉水浴锅电源，使其自然冷却，让互补的单链oligoDNA复性为双链状态；5用BsaI充分酶切sgRNA体外转录载体质粒pUC57Kan-T7-gRNA-U6V2，回收线性质粒片段；6将步骤4获得的双链DNA与步骤5获得的线性质粒片段，用T4DNA连接酶连接，获得重组质粒；7步骤6的连接产物转化感受态细菌，挑取卡那霉素抗性菌落，并扩增培养获得抗性菌液；8利用抗性菌液提取重组质粒，并测序验证；9用内切酶DraI充分酶切测序验证正确的步骤8获得的质粒，实现重组质粒完全、充分的线性化；10纯化线性质粒DNA并去除RNA酶污染；11用无RNA酶的70％乙醇充分洗涤DNA沉淀，之后用无RNA酶的去离子水溶解DNA沉淀；12取1ug步骤11获得的纯化的线性质粒为模板，用体外转录试剂盒MEGAshortscriptTMT7TransciptionKitinvitrogen，美国，目录号AM1354进行体外转录，获得sgRNA操作步骤详见试剂盒说明书；13利用MEGAClearTranscriptionClean-UpKitinvitrogen,美国，目录号AM1908，纯化步骤12获得的体外转录产物，根据浓度大小分装为5-10uL管保存备用操作步骤详见试剂盒说明书。3、Cas9mRNA的制备1转录模板的准备：用AgeI内切酶充分过夜酶切质粒pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9Addgene，美国，目录号#44758，其余步骤同sgRNA体外转录模板的准备。2体外转录：利用mMESSAGEmMACHINET7Ultrakitinvitrogen，美国，目录号AM1345转录Cas9mRNA，实验步骤详见试剂盒说明书。转录完成后向体系中加入1ulTurboDNase，37℃孵育15min，以去除残留的模板DNA。3加尾：1向T7UltraReaction体系中依次加入以下试剂：表1试剂体系2混合后，吸取2.5ulmix作为对照；加入4ulE-PAPenzyme，混合后37℃孵育45min。4mRNA纯化回收:利用Qiagen公司的RNAeasykit，纯化回收mRNA：1将模板用NFW水调至100ul；2加入350ul的RLTBuffer充分混合均匀；3加入250ul的无水乙醇，混匀；4转入试剂盒自带的柱子中，≥8000g，离心15s；5弃收集管中的废液，加入500ul的BufferRPE，≥8000g，离心15s；6重复上述步骤；7将柱子转入新的2ml收集管，空转1min；8将柱子放于1.5ml离心管，加入40ul的RFW，≥8000g，1min；9取2ul测浓度，依据浓度将mRNA溶液按照1-5uL管的体积分装至无RNA酶的EP管中,将分装后的mRNA溶液置于-80摄氏度冰箱冻存。10取1管mRNA电泳，以加尾前的mRNA为对照，检测mRNA的质量及加尾效果加尾后的mRNA的条带位置应稍滞后于加尾前的mRNA。使用前将Cas9mRNA稀释到20ngul。4、猪早期胚胎的获取、CRISPR试剂的显微注射及移植:1猪早期胚胎的获取1选取3-5头处于发情期的健康性成熟母猪，与健康性成熟公猪配种后作为胚胎供体母猪，并另备一头处于发情期的健康性成熟母猪作为受体母猪；2供体母猪配种后24-36h，通过耳缘静脉注入质量分数为3％的戊巴比妥钠溶液10-15mL或利用异氟烷通过呼吸机实现供体猪的全身麻醉，并将母猪绑定于V形手术台上；3常规清洗、消毒母猪腹部之后，沿腹部正中线，在母猪倒数第一和第三对乳头之间，切开腹部皮肤、筋膜、肌肉及腹膜，切口大小为5-8cm；4取出母猪卵巢、输卵管及部分子宫，此时可见母猪卵巢表面排卵出血点，表明母猪已排卵；5将内径为4-6mm两端钝化的玻璃导管，通过输卵管伞部插入输卵管；6用注射器抽取在38℃水浴中充分温育的冲胚液PBS+1％胎牛血清约20mL，通过静脉输液针将含有冲胚液的注射器与输卵管腔相连其含针头一端通过输卵管与子宫的结合部插入输卵管腔，另一端与注射器相连；7通过注射器将冲胚液注入输卵管，并用灭菌的50mL离心管收集流经输卵管、从插入输卵管伞部的玻璃导管中流出的冲胚液；8将收集的冲胚液转入直径为9cm的无菌培养皿中，在体视显微镜下捡取胚胎，此时捡取的胚胎一般为1-cell或2-cell期，如图7所示；9将捡取的猪胚胎置于上覆石蜡油、已在培养箱中充分温育平衡的培养液液滴中培养备用本案例所用的猪胚胎培养液为PZM-3，其配方见文献BiologyofReproduction,2002,66:112；2猪早期胚胎的显微注射：将步骤上述制备的sgRNA,spCas9mRNA和同源重组模板DNA供体DNA，分别以终浓度sgRNA10nguL,spCas9mRNA20nguL和供体DNA10nguL充分混合，之后将混合溶液通过显微注射注入猪早期胚胎的细胞质。详细操作见Hoganetal.ManipulatingMouseEmbryoManipulationManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994,SecondEdition。3猪胚胎移植1依照与胚胎获取相同的方式麻醉和保定受体母猪、切开腹腔、取出卵巢、输卵管及部分子宫；2将捡胚吸管美国，Agtech公司与1mL注射器相连接，并在捡胚吸管中预先吸入一段空气；3在体视显微镜下，通过连接的注射器将培养液中20-30枚注射后的胚胎吸入捡胚吸管中注意：在胚胎所在液段前要吸入一段空气，并在空气前再吸入一段液体，以防污染；4将装有胚胎的捡胚吸管通过伞部插入受体猪输卵管，推动注射器将胚胎导入输卵管中；5将受体猪子宫、输卵管和卵巢放回腹内，依次缝合腹膜、肌肉、筋膜及皮肤，并对创口做常规消毒处理；受孕的受体母猪在妊娠期满后即可产下仔猪。5、基因突变猪的遗传分析1剪取突变猪耳部组织，提取基因组DNA；2在突变靶位点所在的外显子上、下游选取引物，通过PCR扩增获得靶位点附近的扩增产物；3将PCR产物直接送样测序，若测序结果为单一测序峰，说明突变个体为纯合子；如果测序结果含有套峰，则说明突变个体为杂合子；4将杂合子个体的PCR扩增产物进行TA克隆，转化感受态细菌后获得抗性转化菌落，每个个体随机挑取约20个转化菌落送样测序，确定突变个体的基因型。二、实验结果1、序列分析和设计的结果通过比对NCBI上人、猪和小鼠Fgfr3基因编码蛋白氨基酸序列，发现人软骨发育不全突变位点第380位甘氨酸在猪相对应的位点为第378位甘氨酸。比对NCBI上猪Fgfr3参考基因序列，确定该位点位于猪Fgfr3pFgfr3第9号外显子图1B。根据参考基因序列设计引物扩增第9号外显子测序获得巴马小型猪准确的碱基序列，发现巴马小型猪pFgfr3基因的同源突变位点为c.1132GA，导致编码氨基酸密码子GGG突变为AGG，从而引起甘氨酸突变为精氨酸。选取了一个高效的sgRNA位点命名为pFgfr3-G378-sgRNA，其序列为：其中加粗标记的AGG碱基为PAM结构，划线部分为编码第378位甘氨酸的密码子GGG的互补碱基。针对该sgRNA位点，设计并筛选得到了一个可在pFgfr3基因中高效实现人临床中最常见的软骨发育障碍同源突变pFgfr3c.1132GA的DNA同源重组模板供体DNA，命名为：pFgfr3-G378R-ssODN：该模板包含了可导致猪FGFR3蛋白第378位甘氨酸突变为精氨酸的pFgfr3c.1132GA突变，同时在编码猪FGFR3蛋白第377位酪氨酸和第376位丝氨酸的密码子TAC和AGC中分别导入了有2个同义碱基突变，分别为pFgfr3c.1131CT和pFgfr3c.1128CT，以抑制pFgfr3-G378-sgRNACas9蛋白复合体对同源重组后的突变位点进行再切割。为实现同源重组和突变位点的敲入，在上述突变碱基的两侧，分别添加了65个碱基的同源序列。本实施例的序列分析结果和实验设计方案参见图1所示。2、基因突变首建猪的制备及遗传分析通过胚胎移植，获得了5头基因编辑首建猪。剪取耳组织提取基因组DNA，用pFgfr3-E9-F1R1表2引物扩增目的片段，获得PCR产物图2A。将PCR产物直接送PCR产物进行测序，若为单一测序峰，则为突变个体为纯合子，直接确定其基因型；若为测序套峰，则将PCR产物进行TA克隆，转化感受态细菌获得转化抗性菌落后，每个个体随机挑选～20个菌落送样进行Sanger测序。分析发现：在5头编号pF1-1～pF1-5首建猪中，有4头个体编号pF1-1、pF1-2、pF1-4和pF1-5的基因编辑位点的PCR产物测序结果为单峰，通过分析比对发现为预期基因编辑基因型pFgfr3c.1132GA基因型,说明这4个个体为预期基因编辑基因型的纯合子见图2B，C；编号pF1-3的PCR产物测序为套峰，经TA克隆送测序测序，在12个有效测序克隆中：pFgfr3c.1132GA突变基因型1个、pFgfr3c.1127_1128insTA基因型6个、pFgfr3c.1127_1128insG基因型4个、pFgfr3c.1124_1130delCAGCT基因型1个，说明该个体为遗传高度嵌合的个体图2B,C。5个首建猪个体的基因型统计见表3。表2遗传分析扩增引物。表3首建猪基因型统计从上述数据可知：利用本发明选择的sgRNA位点和设计的供体DNA，首建猪中有80％的个体为预期敲入基因型pFgfr3c.1132GA的纯合突变个体，表明本发明所用的sgRNA位点pFgfr3-G378-sgRNA和供体DNApFgfr3-G378-ssODN具有极强的基因编辑活性；通过将上述基因突变首建猪进行横交配种，即可培育软骨发育异常的FGFR3p.G378R纯合或杂合突变猪，即巴马小型猪软骨发育不全ACH模型。同时，利用本发明选择和设计的基因编辑试剂，还可获得Fgfr3基因发生移码突变的基因型，通过首建猪的横交配种可培育Fgfr3基因发生完全敲出的突变猪，该突变猪可作为骨骼过度生长、且脊柱发生侧弯的动物模型。3、基因突变猪的表型分析在获得的5头首建猪中，主要以移码突变为主的pF1-3号个体，呈现显著的四肢修长的表型图3A；将pF1-3个体进行尸检发现：其脊柱呈现明显的侧弯表型图3A，这符合Fgfr3基因敲出突变的临床和动物模型小鼠的表型。表明，利用本发明sgRNA不但可以制备pFgfr3c.1132GA点突变模型，还可高效制备pFgfr3敲出的脊柱侧弯动物模型。为了排除首建动物可能存在的遗传嵌合的影响，选取耳部组织呈纯合预期基因敲入突变pFgfr3c.1132GA的雄性首建猪pF1-5号个体与野生型母猪配种，获得F1代的pFgfr3c.1132GA杂合突变个体和同窝的野生型个体。发现：与同窝正常个体相比，F1代pFgfr3c.1132GA杂合突变个体呈现明显的四肢粗短的症状图3B，这与前期的人临床和小鼠模型的研究结果一致。进一步分析突变猪的骨骼发育表型，发现胫骨、股骨与肱骨等长骨的长度均较野生明显短缩，分别为对照的84.4％、84.5％与90.8％见图4。进一步通过X光摄片观察，发现在相同的投照条件下，ACH猪长骨骺端的透光度均较野生型猪明显减低图5；头颅较野生猪圆钝，颅腔投影面积明显变小，长度有变短趋势，而宽度明显变窄图6。由于X线照片不能量化骨量，又对股骨进行了X线双能骨密度测定，结果显示突变猪全股骨、股骨中段骨密度及末端干骺端骨密度分别较野生型猪降低了7.2％、8.4％与9.8％图7。上述结果说明FGFR3突变后其功能增强突变可导致突变猪骨量减少。FGFR3的表达主要影响软骨内成骨过程。生长板是长骨生长的原动力。通过猪干骺端组织学切片初步观察发现，突变猪基质深染的肥大软骨细胞减少图8；进一步分析生长板表型发现，野生猪的生长板有序的分为静息带、增殖带与肥大带，而突变猪的生长板柱状结构排列紊乱，在各个带均可见少量散在的小而圆的静息样软骨细胞，提示其生长板发育过程受到明显影响图9。序列表中国人民解放军陆军军医大学用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用9SIPOSequenceListing1.0123DNA人工序列ArtificialSequence1gaaagcccagcccgtagctgagg23220DNA人工序列ArtificialSequence2gaaagcccagcccgtagctg20396DNA人工序列ArtificialSequence3gaaagcccagcccgtagctggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc60cgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc9645DNA人工序列ArtificialSequence4ttata55130DNA人工序列ArtificialSequence5ccgaggaggagctggtggaggctggtgaggctggcagtgtgtacgcgggggtcctcagtt60ataggctgggctttctcctcttcatcctggtggtggccaccgtgacactctgccgcctgc120gcagcccccc130622DNA人工序列ArtificialSequence6taggaagcccagcccgtagctg22722DNA人工序列ArtificialSequence7aaaccagctacgggctgggctt22826DNA人工序列ArtificialSequence8ccgaggaggagctggtggaggctggt26924DNA人工序列ArtificialSequence9ctgtcgcttgagcgggaagcggga24

权利要求：1.制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA，其识别位于猪成纤维细胞生长因子受体3编码基因上，核苷酸序列为5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTGAGG-3’的靶位点。2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于其识别靶位点的引导序列为：5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTG-3’。3.根据权利要求2所述的sgRNA，其特征在于核苷酸序列为：5’-GAAAGCCCAGCCCGTAGCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3’。4.用于与权利要求1或2所述的制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA配合使用，将猪的成纤维细胞生长因子受体3编码基因上编码第378位甘氨酸的密码子突变为精氨酸密码子的供体DNA。5.根据权利要求4所述的供体DNA，其特征在于：将猪的成纤维细胞生长因子受体3编码基因上编码第378位甘氨酸的密码子突变为精氨酸密码子猪Fgfr3c.1132GA突变；优选的，所述的供体DNA为：双链供体DNA或单链供体DNA；优选的，所述的供体DNA中包含以下核心序列：5’-TTATA-3’或其互补序列；优选的，所述的供体DNA中的核心序列两侧还包含50～70个碱基的同源序列；优选的，所述的供体DNA的核苷酸序列为：5’-CCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGGTGAGGCTGGCAGTGTGTACGCGGGGGTCCTCAGTTATAGGCTGGGCTTTCTCCTCTTCATCCTGGTGGTGGCCACCGTGACACTCTGCCGCCTGCGCAGCCCCCC-3’或为其互补序列。6.制备骨骼发育异常猪模型的试剂盒，包括以下成分：权利要求1～3任一项所述的sgRNA和或权利要求4～9任一项所述的供体DNA；优选的，所述试剂盒还包括编码spCas9蛋白的mRNA和或spCas9重组蛋白。7.制备骨骼发育异常猪模型的方法，其特征在于包括以下步骤：a、将权利要求1所述的sgRNA、权利要求4～9任一项所述的供体DNA、编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；b、将步骤a处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；c、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到骨骼发育异常猪模型。8.根据权利要求11的方法，其特征在于：所述的sgRNA、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和或spCas9纯化重组蛋白之间的配比例为按在混合物中的终浓度sgRNA10～15nguL、spCas9mRNA和或spCas9纯化重组蛋白20～25nguL、以及供体DNA5～10nguL。9.根据权利要求12的方法，其特征在于：所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。10.据权利要求13的方法，其特征在于所述的步骤c中还包括有检测验证步骤：使用pFgfr3-E9-F1R1表1引物扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型pFgfr3c.1132GA，若含有该基因型即表明建模成功。

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