申请/专利权人：江苏省农业科学院

申请日：2023-09-25

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN117210615B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2023.12.29#实质审查的生效;2023.12.12#公开

摘要：本发明公开了一种猪曼那角病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法与应用，涉及分子生物学技术领域。该猪曼那角病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法包括以下步骤：引物和探针的设计与合成；病毒阳性质粒标准品合成；RT‑qPCR反应体系优化；RT‑qPCR标准曲线建立；RT‑qPCR方法评价；临床样品检测。该猪曼那角病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法与应用，具有特异性强、准确性、灵敏性高、重复性好的优点，适用于猪场大规模检测诊断，对监测和防控猪曼那角病毒具有重要作用。

主权项：1.一种非诊断目的猪曼那角病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：S1：引物和探针的设计与合成，在NCBI上检索猪曼那角病毒的基因序列，将不同毒株的序列在DNAMAN软件上进行序列比对，选择同源性高，且是基因组保守区域的V-P段作为目标基因片段；S2：病毒阳性质粒标准品合成；S3：RT-qPCR反应体系优化；S4：RT-qPCR标准曲线建立；S5：RT-qPCR方法评价；S6：对临床样品进行检测；所述S1进一步的包括：利用BeaconDesigner、Oligo7、NCBIBLAST，依据探针设计原则设计探针，并对探针进行验证，筛选最佳探针；确定目的探针序列的位置后，在探针位置前后，利用PrimerPremier5、Oligo7、Primer-BLAST软件，依据引物设计原则设计引物，并对其进行验证，筛选最佳引物对；所述S3包括：S31：梯度法筛选最佳退火温度；S32：矩阵法筛选最优引物和探针浓度；合成的阳性质粒按10倍浓度梯度稀释，用优化后的体系进行RT-qPCR试验，绘制标准曲线；所述S5包括：S51：特异性试验，采用所述检测方法检测多种病毒，仅猪曼那角病毒出现扩增曲线，除猪曼那角病毒的其他病毒检测结果均为阴性；S52：敏感性试验，验证该方法检测到的猪曼那角病毒最低拷贝数；S53：重复性试验，将10倍稀释V-P质粒重复测定，n＝3，验证该方法的重复性；设计合成的引物探针包括MenV-pV-F、MenV-pV-R以及MenV-Probe；MenV-pV-F的引物序列为5’-TCCTCGTCATAAAGACAGAA-3’；MenV-pV-R的引物序列为5’-GGTGACATATTGGGTTGC-3’；MenV-Probe的序列为5'-FAM-AATAATGTCTATGATGCCGCTCCAATC-BHQ1-3'。

全文数据：

权利要求：

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