申请/专利权人：天士力生物医药股份有限公司

申请日：2018-11-16

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN109879969B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;A61K38/10;A61K47/68;A61P37/02;A61P9/10;A61P29/00;A61P19/02;A61P19/08

优先权：["20171206 CN 2017112734739"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2020.08.18#实质审查的生效;2019.06.14#公开

摘要：本发明属于生物制药技术领域，更具体的说，涉及一种长效HM‑3融合蛋白分子及其应用。本发明在HM‑3分子序列的基础上，由活性多肽HM‑3及其衍生物通过连接肽Linker或直接与人源FcIgG片段或FcIgG突变体片段连接，形成全新的分子实体。其通式为HM‑3n‑Linker‑FcIgG、FcIgG‑Linker‑HM‑3n、或者HM‑3n‑Linker‑FcIgG‑Linker‑HM‑3n。本发明有效延长了HM‑3半衰期，且成本低廉，克服了小肽成药性的关键难题。可作为一种治疗自身免疫疾病、新生血管疾病以及骨关节炎等极具潜力的药物。

主权项：1.一种融合蛋白，由活性多肽HM-3与人源IgG-Fc片段或IgG-Fc突变体片段连接形成，其特征在于，所述融合蛋白选自：TSL-4融合蛋白：mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3，氨基酸序列如序列表12所示。

全文数据：一种HM-3融合蛋白及其应用技术领域本发明属于生物制药技术领域，更具体的说，涉及一种长效HM-3融合蛋白分子及其应用。背景技术自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，如果不加以及时有效的控制，自身免疫性疾病的后果十分严重，最终甚至危害生命。常见的自身免疫疾病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病、自身免疫性肝病，等等。类风湿关节炎rheumatoidarthritis，RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。血管炎病变累及全身各个器官，故本病又称为类风湿病。以类风湿关节炎为代表的炎性自身免疫性疾病，发病率和致残率高，我国患者逾千万人，是影响人类健康和生存质量的重大疾病。TNFα抑制剂是目前类风湿性关节炎治疗的主流生物制剂；2013年humira，enbrel，remicade等三款TNFα抑制剂的总销售额为281.08亿美元，占据全球类风湿市场总销售额的84.58％。然而，TNF抑制剂需与甲氨蝶呤联合使用才能更好地发挥疗效，而部分类风湿性关节炎患者对甲氨蝶呤不能耐受，导致此类患者不能使用联合治疗方案。此外，临床统计表明，采用TNFα抑制剂联合治疗方案后仍有约30％—40％的患者对该治疗方案无应答，未能达到主要治疗指标症状缓解20％。因此目前各大主流制药公司在研风湿关节炎治疗生物药物热门靶点除TNFα抑制剂外，还在积极进行JAK抑制剂，白细胞介素抑制剂、炎细胞浸润抑制剂亲环素以及整合素阻断剂的研究，这些药物可与TNFα抑制剂互为补充，为不同类型的类风湿性关节炎患者提供多种用药选择。所谓新生血管，就是从一般血管新伸出的螺旋状毛细血管。人体在怀孕等一定条件下，可以出现新的血管，除此之外如果出现新生血管时，即会引发特定的疾病，这些疾病总称为“血管新生疾病”，如癌症、湿性黄斑变性等等。湿性黄斑变性又被称为新生血管性的黄斑变性，主要临床特征为形成了脉络膜新生血管。骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。HM-3是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列RGD序列的18个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列如下：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。HM-3为已知结构，在CN1314705C中已经公开，其对整合素αvβ3具有高度亲和性，通过阻断整合素αvβ3信号通路、抑制VEGF和TNFα的表达，从而抑制内皮细胞迁移和新生血管的生成，进而抑制RA滑膜增生。小鼠体内急性、亚急性、慢性炎症试验表明：HM-3可同时抑制血管新生和炎症反应、调节胶原型关节炎DBA1小鼠滑膜组织VEGF和TNFα含量，有效的缓解RA症状，其治疗效果优于甲氨蝶呤。虽然HM-3分子具有药效明确、安全性好的优势，该小肽的体内半衰期仅为27.66±7.37min，如该产品应用于临床，则需每日给药1次至2次，极大地限制了临床应用。在本领域中，对分子结构进行修饰或改造是解决半衰期较短、需连续给药问题的常用方法，其中以化学修饰应用最为广泛。中国专利申请CN102417540A中公开了一种聚乙二醇修饰的HM-3：mPEG-SC-HM-3，其半衰期远远高于HM-3。然而，PEG修饰技术本身存在种种问题。PEG修饰是通过覆盖蛋白降低免疫原性和提高半衰期的，这就造成PEG修饰并不适用于所有蛋白，有些蛋白由于修饰位点不暴露无法正常修饰；有些蛋白活性位点被覆盖造成活性下降；有些蛋白修饰后构象变化导致活性降低或者容易聚集。PEG修饰产物必须通过降解PEG分子，逐步暴露药物蛋白，但低分子量的PEG有肾脏毒性，高分子量的PEG体内降解机理不清楚，这给PEG修饰药物带来明显的用药风险。另外，由于PEG修饰涉及复杂的蛋白处理过程，且PEG分子长度存在差异，造成PEG修饰产物的分子量不均一，增加生产成本的同时，降低了成品的均一性，给产业化带来难题。为克服HM-3蛋白体内半衰期短、多肽合成成本高，不太适合工业化生产等问题，本发明提供一种HM-3-Fc融合蛋白及其应用。发明内容本发明发现，将HM-3和Fc制备成融合蛋白，可以延长HM-3半衰期，同时提高了药物活性。本发明发现，该融合蛋白，在体内外都体现出了更高的生物活性和稳定性，能够显著抑制炎症反应，缓解自身免疫疾病、新生血管疾病、骨关节炎的症状，同时具有长效血浆半衰期。为此，本发明公开了一种HM-3-Fc融合蛋白，所述融合蛋白由活性多肽HM-3与人源IgG-Fc片段或IgG-Fc突变体片段连接形成。本发明的融合蛋白，由HM-3和人源的IgG-Fc片段或IgG-Fc片段的突变体通过C端或N端或C端和N端同时连接，制备得到，其连接可以通过一个连接肽连接。本发明的融合蛋白可以通过以下结构描述：HM-3n-Linker-IgG-Fc、IgG-Fc-Linker-HM-3n、或HM-3n-Linker-IgG-Fc-Linker-HM-3n；其中n选自1，2，3，4或5。其中Linker代表连接肽，所述连接肽选自：①、GGGGSa，其中a为1，2，3，4，5或6；②、AEAAAKbA，其中b为1，2，3，4，5或6；③、APc，其中c为1至18；④、Gd，其中d为1至15；优选的连接肽为GGGGSa序列，重复数a优选3，4或5。其中，所述IgG-Fc为人源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段或其突变体片段；其中优选的为IgG2、IgG4的Fc或其突变体；最优选为突变体mIgG4-Fc。本发明的融合蛋白，优选以下序列的融合蛋白：TSL-1融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG2-Fc；TSL-2融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc；TSL-3融合蛋白：IgG2-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-4融合蛋白：mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-5融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG4-FcTSL-6融合蛋白：IgG4-Fc-GGGGS3-HM-3TSL-13融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3TSL-14融合蛋白：HM-3-HyFcTSL-15融合蛋白：mIgG4-Fc-G5-HM-3-G8-HM-3TSL-16融合蛋白：HyFc-GGGGS3-HM-3TSL-17融合蛋白：mIgG4-Fc-AEAAAK4A-HM-3TSL-18融合蛋白：mIgG4-Fc-AP9-HM-3本发明所述的融合蛋白，可以通过合成的方法制备，所述合成方法，是将HM-3多肽和Linker通过共价键连接，再通过合成方法Linker的另一端和IgG-Fc连接。也可以通过基因重组的方法获得，如采用酵母、CHO、SP20、BHK和或HEK293细胞进行表达；优选采用CHO细胞和或HEK293细胞进行表达。本发明所述的融合蛋白，可以提高药物在体内的作用时间，延长半衰期，提高患者的顺应性和依从性。本发明进一步提供含有本发明的融合蛋白的药物组合物，所述药物组合物以适合药用的制剂形式存在，所述制剂形式选自：注射剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、或气雾剂，给药方式包括口服、静脉注射、静脉滴注、皮下或肌肉注射。本发明进一步提供使用本发明的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。优选所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎,并具有药代动力学特性。本发明进一步提供使用本发明的融合蛋白在制备治疗新生血管疾病的药物中的应用。优选所述新生血管疾病为湿性老年黄斑变性、肿瘤转移。本发明的融合蛋白可以作为眼科用药，在眼部特别是房水及玻璃体具有药代动力学特性。本发明进一步提供使用本发明的融合蛋白在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。本发明的融合蛋白可以对软骨细胞产生保护作用，并通过软骨细胞病理学改变，发挥预防和治疗骨关节炎的作用，同时具有药代动力学特性。本发明所述的融合蛋白，在采用基因重组法制备时，先合成编码本发明融合蛋白的DNA分子，所述DNA的核苷酸序列优选的为序列表1的序列。本发明在采用基因重组法制备时，将合成的DNA分子通过质粒制备成重组表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体，如pcDNA3.4Invitrogen公司。本发明进一步将表达载体转染宿主细胞，优选哺乳动物表达细胞，更优选HEK293细胞、CHO细胞。经对宿主细胞表达培养，从细胞培养液中分离出本发明的融合蛋白，经过纯化分离即可得到本发明的融合蛋白。本发明为此进一步提供本发明融合蛋白的纯化方法，优选地使用ProteinA或ProteinG亲和层析柱进行纯化。附图说明：图1TSL-4蛋白亲和捕获图图2TSL-4蛋白的进一步分离纯化图图320160308批电泳图图420160308批HPLC-SEC图图5TSL-5和TSL-6纯化后电泳图图6TSL-1～4融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制效果对比图图7TSL-13～18融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制效果对比图图8三种Fc片段、两种连接方向融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制效果对比图图9三种Linker融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制效果对比图图10含不同数量HM-3的融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制效果对比图图11TSL-1～4融合蛋白对人巨噬细胞U937炎性因子TNF-α的抑制作用对比图图12TSL-1～4融合蛋白对斑马鱼血管形成抑制率对比图图13TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠体重的影响图图14TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠足掌后度的影响图图15TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠足踝宽度的影响图图16TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠足周长的影响图图17TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠关节炎评分的影响图图18TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠脾脏以及胸腺重量的影响图图19TSL-4对II型胶原型关节炎小鼠足重的影响图图20单次皮下注射12.5mgkg的TSL-4后的血药浓度时间曲线图图21单次皮下注射37.5mgkg的TSL-4后的血药浓度时间曲线图图22单次皮下注射4.17mgkg的TSL-4后的血药浓度时间曲线图图23大鼠单次皮下注射不同剂量TSL-4后平均血药浓度时间曲线图图24血浆中TSL-4峰浓度Cmax与给药剂量的关系图图25药时曲线下面积与给药剂量的关系图图26关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后6个时间点PETCT扫描放射性摄取图图27关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后分别在48h和120h时间点PETCT扫描放射性摄取图图28关节炎模型大鼠左踝关节腔注射89Zr-HM-3后6个时间点放射性摄取图图29关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后分别在48h、120h时间点采集组织放射性摄取图具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明。实施例1，HM-3融合蛋白的分子设计HM-3-Fc融合蛋白由3部分组成，包括活性部分HM-3多肽，linker，以及人源IgG-Fc片段或IgG-Fc突变体片段；其具体设计方法如下：1、FC片段的选择人IgG型抗体根据重链的不同，共有四种亚型，分别是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四种。已有的研究成果表明，四种亚型在血浆半衰期、细胞毒性等特征上均有所差异见表1，且与Fc片段直接相关。IgG3的体内半衰期最短，其Fc片段不太适宜作为伴侣分子延长目的蛋白的体内半衰期，经过试验首先被排除掉。而Fc片段对补体、Fc受体的亲和力决定了抗体依赖的细胞毒性ADCC效应以及补体依赖的细胞毒性的能力CDC效应效应功能，IgG1和IgG3具有最强的ADCC、CDC效应，经试验确定不适于构建为以健康细胞为靶点的融合蛋白，因此IgG1和IgG3的Fc片段均被筛选后排除。基于所开发适应症为自身免疫性疾病，靶点为正常体细胞，仅需抑制信号通路，并尽可能延长体内半衰期，所以需要低的或者是没有ADCC效应以及CDC效应，据此HM-3融合蛋白FC部分更适宜选择IgG2或IgG4的Fc片段。而为了进一步改良天然Fc片段的特性，本发明也将IgG2和IgG4的Fc片段突变体扩大考虑在筛选范围之内。表1，4种IgG亚型性质比较2、Linker的选择Linker是连接功能蛋白和伴侣蛋白的多肽链，Linker的序列及长度对融合蛋白功能具有至关重要的作用。Linker的选择需要考虑如下几个方面：1长度要适中，太短无法保证蛋白之间空间上的相对独立，太长则可能增加Linker断裂、及引起免疫原性的风险；2Linker的序列不能包含蛋白酶切位点，避免被切断；3Linker可选择天然Linker、人工Linker；4Linker可分为刚性Linker和柔性Linker。经过大量实验本发明选择4种人工设计Linker作为验证备选：①GGGGSa，是使用最为广泛的柔性Linker，其中a可以为1，2，3，4，5或6；②AEAAAKbA，是α-螺旋刚性Linker，其中b可以为1，2，3，4，5或6；③APc，是直链刚性Linker，其中c可以为1至18；④Gd，是类似于GGGGSn的柔性Linker，其中d可以为1至15。3.HM-3与Fc部分融合顺序由于氨基酸序列方向的唯一性，两个蛋白质的融合存在两种连接方式，N－端连接指将功能蛋白连接到Fc片段的N－端，而C－端连接则指将功能蛋白连接到Fc片段的C－端。4.备选融合蛋白结构设计结合上述融合蛋白设计需要考虑的因素，至少可以产生超过300种融合蛋白结构，一一进行表达并验证药效是不现实的，因此从单因素比较的思路出发，首先选择最常用的GGGGS3Linker，设计了如下六种分子：TSL-1融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG2-Fc；TSL-2融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc；TSL-3融合蛋白：IgG2-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-4融合蛋白：mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-5融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG4-FcTSL-6融合蛋白：IgG4-Fc-GGGGS3-HM-3随后在上述6种结构的基础上，通过单一因素替换，再引入HyFc、刚性Linker、重叠肽等设计思路，形成6种新的融合蛋白结构：TSL-13融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3TSL-14融合蛋白：HM-3-HyFcTSL-15融合蛋白：mIgG4-Fc-G5-HM-3-G8-HM-3TSL-16融合蛋白：HyFc-GGGGS3-HM-3TSL-17融合蛋白：mIgG4-Fc-AEAAAK4A-HM-3TSL-18融合蛋白：mIgG4-Fc-AP9-HM-3以上氨基酸序列见序列表。上述12种融合蛋白作为最具代表性的备选蛋白结构，同步进行细胞表达、体外药效学实验，获得体外药效实验结果，通过不同的比较方式，可以对各个结构变量进行比较，筛选出最佳融合蛋白结构。随后通过体内药效学，药代动力学，毒理学等评价其成药的可能性，从而进一步开发成治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的创新药物。实施例2：载体的构建，12种融合蛋白基于相同的设计途径、使用相同的表达载体，因此瞬时转染表达载体构建过程完全一致，以mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3TSL-4融合蛋白为例，介绍表达载体的构建过程。TSL-4融合蛋白采用mIgG4-Fc片段与一个HM-3分子相连，Linker采用GGGGSa，其中a为3。将组成TSL-4各个部分的氨基酸序列，按照mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3的顺序进行拼接后，序列见序列表12。mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3融合蛋白对应的DNA序列见序列表1为了适应CHO或HEK293等真核细胞分泌表达，添加必要的Kozak序列及信号肽，获得完整的mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3表达序列，DNA序列见序列表2。委托生物技术公司全合成上述DNA序列，并通过亚克隆与invitrogen公司的商业化表达载体pcDNA3.4-TOPOvector进行连接，获得表达载体pcDNA3.4-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3。表达载体保存于E.coliDH5α，以甘油管的形式，寄送到实验室，-80℃保存。实施例3：表达载体保存菌株的长期保存在无菌条件下，将含有pcDNA3.4-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM3的E.coliDH5α甘油管解冻，按照1％接种量，接种到含50ml100ugmlAmp抗性LB培养基的250ml摇瓶中，37℃，160rpm震荡过夜培养。随后在无菌条件下，向菌液中加入25ml无菌60％甘油，充分混匀后，按1ml支，将菌液分装至无菌的1.5ml离心管中，完成甘油管的制备，-80℃长期保存。实施例4，表达载体的制备所有用于转染细胞的载体必须无菌、且控制内毒素，因此所有表达载体的制备，均选用Roche公司的GenopureplasmidMaxiKit进行质粒大提，并对质粒进行无菌处理。1质粒提取前一天早上，从-80℃中取出一支甘油管，在无菌条件下，按照1％接种量，将菌液接种至含5ml100ugmlAmp抗性LB培养基的试管中，37℃，160rpm震荡培养6～8h。2在无菌条件下，将试管中的菌液全部接入含500ml100ugmlAmp抗性LB培养基的2L摇瓶，37℃，160rpm震荡过夜培养。3使用Roche公司的GenopureplasmidMaxiKit进行质粒大提。方法如下：a.在4℃下，3000-5000g离心5-10min，收集500ml的E.coli菌体。加入24ml重悬缓冲液SuspensionBuffer，含有RNase，充分重悬菌体。b.加入24ml裂解缓冲液LysisBuffer，颠倒混匀6-8次，室温静置2-3分钟。c.加入24ml中和缓冲液NeutralizationBuffer，立即颠倒混匀6-8次，出现絮状沉淀。d.净化溶菌液。在4℃使用12000g以上速度，离心45min以上，小心将上清移至吸附柱。e.在吸附柱上套上试剂盒中自带的纸环，放置在锥形瓶口，在吸附材料上滴加6ml的平衡缓冲液EquilibrationBuffer。f.将e中得到的清洁菌裂解液加入吸附柱中，靠重力自然流过。弃流穿液。g.吸附柱中加入12ml冲洗缓冲液WashBuffer，靠重力自然流过，弃流穿液。重复两次。h.在超净台中，将吸附柱放置在去内毒素、无菌50ml圆底高速离心管上，加入50℃预热的14ml洗脱缓冲液ElutionBuffer，重力流过。i.加入20ml异丙醇，沉淀质粒DNA，在4℃使用大于15000g离心30min，超净台中小心弃上清。此步需要特别注意，有时质粒并未形成固体沉淀，而是形成粘稠液体处于离心管底部，使用移液管出去上层大部分液体，然后小心将剩余上清移入一个无菌尖底离心管，如15ml离心管或50ml离心管，尽量不要吸到含质粒粘稠液体。随后，观察尖底离心管，将底部不小心吸到的含质粒粘稠液体吸回圆底离心管。j.使用4ml预冷的75％乙醇，拧紧离心管盖，旋转离心管，让75％乙醇湿润整个离心管内部，一方面将可能残余在管壁的质粒洗下，另一方面对整个离心管内壁除菌。在4℃使用大于15000g离心10min。重复一次。k.在超净台中，倒掉75％乙醇，用10ul移液器小心吸掉残余液体，将离心管倒置在吸水纸上干燥约20分钟。l.在超净台中，使用200-400ul无菌ddH2O，完全浸泡固体质粒，拧紧离心管盖，4℃倾斜静置离心管过夜，让质粒完全溶解。超净台中将质粒移入无菌1.5ml离心管中，取2ul用于浓度检测。根据浓度检测结果，使用无菌ddH2O将质粒浓度调整至1ugul，使用无菌0.22μm滤膜过膜除菌，并取5ul质粒接种于含有5ml无抗性LB培养基的试管中，37℃过夜震荡培养，确认无菌。至此完成无菌质粒的制备。4℃或-20℃保存质粒DNA.至此，完成表达载体的制备工作。实施例5，融合蛋白快速表达ThermoFisher公司的Expi293ExpressionSystem是基于293F细胞一种经过筛选的HEK293细胞瞬时转染的商业化的快速蛋白制备试剂盒，用于融合蛋白的快速获取。所用12种融合蛋白的制备均遵循下述实验方案进行。1.根据Expi293ExpressionSystem使用说明，使用2L摇瓶进行实验时，每瓶细胞最终体积为800ml。2.转染的Expi293F细胞，从复苏算起，最少进行三次传代。传代过程中根据实验需要，依次扩大培养规模。3.瞬时转染前一天，按照2×106cellsml活细胞密度接入总体积为1200mlExpi293ExpressionMedium，37℃，8％CO2，125rpm震荡培养。4.瞬时转染当天，先对前一天培养的细胞计数，细胞密度应为3-5×106cellsml，活率大于95％。调整细胞密度为3×106cellsml，每个2L摇瓶中的细胞体积调整至680ml。5.800ug质粒DNA复溶于40ml的Opti-MEMIReducedSerumMedium，轻柔混匀。6.2.16mL的ExpiFectamine293Reagent加入Opti-MEMIReducedSerumMedium，定容至40ml。轻柔混匀，室温孵育5min长时间孵育影响转化效率。7.上述两种溶液混合，轻柔混匀，室温孵育20-30min。完成质粒-转染试剂混合液准备工作。8.将80ml质粒-转染试剂混合液加入第4步的细胞培养液中，共760ml。9.37℃，8％CO2，125rpm震荡培养18h。10.加入4mL的ExpiFectamine293TransfectionEnhancer1和40ml的ExpiFectamine293TransfectionEnhancer2。至此，总体积为804ml。11.37℃，8％CO2，125rpm震荡培养。12.转染后第六天结束发酵，取样使用免疫比浊仪检测产量，并进行蛋白纯化。实施例6，融合蛋白的纯化由于12种融合蛋白本质上均为Fc融合蛋白，可以用ProteinA亲和层析柱进行特异性捕获，实际纯化过程中，发现纯化参数完全一致，因此此处以某一批TSL-4蛋白的纯化为例，介绍融合蛋白的纯化流程。1.样品预处理：20160308批1.60L发酵液采用BeckmanJ×25离心机，500ml离心杯，7500rmp，20min,4℃，所获得上清液约1.46L用于下一步proteinA捕获；2.目的蛋白亲和捕获：色谱柱信息如下方法信息如下：1首先用500ml的0.2MNaOH进行灭菌，流速10mlmin；220mMPB，0.15MNaCl，pH7.0缓冲液平衡色谱柱，体积约为1000ml，流速20mlmin；3上样：样品预先调节pH至中性，流速20mlmin；420mMPB，0.15MNaCl，pH7.0缓冲液冲洗色谱柱，约800ml，流速20mlmin；550mM柠檬酸-柠檬酸钠，0.15MNaCLpH3.0缓冲液洗脱目的蛋白，起峰20mAu开始收集，峰后20mAu停止收集；流速20mlmin；6色谱柱最后用500ml0.2MNaOH溶液清洗色谱柱，用ddH2O水冲洗至中性后，用20％乙醇保存色谱柱；合并样品体积约138ml，用1NNaOH20ml调节pH4.12至7.0，洗脱液由略混浊变至澄清。测定结果如图1所示。3.凝胶层析进行进一步的分离纯化色谱柱参数：方法信息：1用0.5MNaOH300ml对色谱柱进行灭菌，流速10mlmin，后用超纯水冲洗至约中性；2用PBS缓冲液，pH7.4平衡色谱柱，平衡体积约为1500ml，流速10mlmin；3上样，样品为proteinA洗脱液，上样量40ml；4收集样品，峰3为目的蛋白峰，收集峰3，起峰10mAU开始收集，峰后10mAu停止收集；5最后用0.1MNaOH保存色谱柱，流速10mlmin。测定结果如图2所示。4.样品超滤浓缩：对峰3的样品进行合并超滤浓缩，超滤膜选用10kDa，样品浓缩至目的蛋白浓度大于5mgml，然后分装样品，于-80℃冰箱保存。本批次起始合并样品体积约550ml，浓度约0.29mgml，最终浓缩至27ml，浓度约为5.53mgml；分装样品，冻存。5.最终样品的纯度如图3所示，20160308批电泳纯度约为96.9％；如图4所示，20160308批HPLC-SEC纯度约为99.3％。遵循相同的纯化流程，成功表达并制备了12种融合蛋白：TSL-1融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG2-Fc；TSL-2融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc；TSL-3融合蛋白：IgG2-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-4融合蛋白：mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3。TSL-5融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG4-FcTSL-6融合蛋白：IgG4-Fc-GGGGS3-HM-3TSL-13融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3TSL-14融合蛋白：HM3-HyFcTSL-15融合蛋白：mIgG4-Fc-G5-HM-3-G8-HM-3TSL-16融合蛋白：HyFc-GGGGS3-HM-3TSL-17融合蛋白：mIgG4-Fc-AEAAAK4A-HM-3TSL-18融合蛋白：mIgG4-Fc-AP9-HM-3在蛋白制备过程中，如图5所示，发现TSL-5、6两种融合蛋白存在严重的二聚体降解问题，大量以单体形式存在，说明使用IgG4-Fc制备的融合蛋白不能稳定形成二聚体，因此淘汰TSL-5和TSL-6两种融合蛋白设计方案。实施例7：融合蛋白小鼠脾淋巴细胞增殖抑制实验实验方法：将小鼠眼眶放血致死，立即放入75％乙醇浸泡5～10min，于超净工作台中取出脾脏放入PBS中。将脾脏置于无菌细胞筛上200目，用注射器头研磨，中途需要不断加入PBS，收集研磨液离心1000转分，5min，用Tris-氯化铵溶液洗涤细胞3次，再用培养基洗涤一遍，然后用培养基重悬。最后将细胞进行台盼蓝活细胞染色，存活率95％以上。调整活细胞浓度为2×106个mL，于96孔板每孔加入细胞100μL，同时加入ConA刀豆蛋白，刺激脾细胞增殖与药物，每组设置6个复孔。将96孔板在37℃，5％CO2培养箱中孵育48h。向96孔板中加入5mgmL的MTT，每孔20μL，于培养箱中继续培养4h。弃去96孔板中的培养液，每孔加入100μLDMSO，轻轻混匀。用酶标仪于测量波长570nm，参比波长630nm处测定吸光值。按照公式计算增殖抑制率Proliferationinhibitionrate,PI：其中Atest为加药组的吸光值，Acontrol为阴性对照组的吸光值。试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P左踝关节腔＝右踝关节腔＝脊柱骨心脏＝肌肉肝脏；12h时，心脏放射性摄取％IDg最高0.90±0.04，其次肾脏肝脏肺脏左踝关节腔右踝关节腔脊柱骨肌肉；24h时，肾脏放射性摄取％IDg最高1.28±0.05，其次是心脏肝脏左踝关节腔右踝关节腔肺脏脊柱骨肌肉；48h时，肾脏放射性摄取％IDg最高2.08±0.19，其次是心脏右踝关节腔肝脏左踝关节腔肺脏脊柱骨肌肉；120h时，肾脏放射性摄取％IDg最高3.89±0.08，其次是脊柱骨肝脏心脏右踝关节腔左踝关节腔肺脏肌肉；192h时，肾脏放射性摄取％IDg最高4.42±0.11，其次是脊柱骨肝脏右踝关节腔左踝关节腔心脏肺脏肌肉。关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后，心脏在1h时放射性摄取％IDg最低0.01±0.01，在24h时最高1.02±0.12，然后随着时间的延长逐渐降低；肺脏、左踝关节腔、右踝关节腔在1h时放射性摄取％IDg最低，分别为0.04±0.06、0.01±0.00、0.01±0.00，在48h时最高，分别是0.50±0.09、0.52±0.09、0.73±0.42，然后随着时间的延长逐渐降低；肝脏、肾脏、脊柱骨在1h时放射性摄取％IDg最低，分别是0.00±0.00、0.04±0.01、0.01±0.00，随着时间的延长逐渐增加，在192h时最高，分别是1.02±0.27、4.42±0.11、1.02±0.05；肌肉在1h时放射性摄取％IDg最低0.01±0.01，在120h最高0.14±0.04。具体结果见图26。表17关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后分别在48h和120h时间点PETCT扫描放射性摄取％IDg如表17所示，关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后48h时间点先进行PETCT扫描然后采集组织伽马计数，肾脏放射性摄取％IDg最高2.60±0.09，其次是心脏肝脏肺脏脊柱骨左踝关节腔右踝关节腔肌肉；关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后120h时间点先进行PETCT扫描然后采集组织伽马计数，肾脏放射性摄取％IDg最高3.72±0.70，其次是心脏肝脏脊柱骨肺脏左踝关节腔右踝关节腔肌肉。具体结果见图27。表18关节炎模型大鼠左踝关节腔注射89Zr-HM-3后6个时间点放射性摄取％IDg如表18所示，关节炎模型大鼠左踝关节腔注射89Zr-HM-3后1h时，左踝关节腔放射性摄取％IDg最高42.20±17.33，其次是心脏肝脏肾脏肺脏右踝关节腔脊柱骨肌肉；24h时，左踝关节腔放射性摄取％IDg最高6.50±3.06，其次是肾脏心脏肝脏肺脏右踝关节腔脊柱骨肌肉；48h时，左踝关节腔放射性摄取％IDg最高2.75±0.64，其次是肾脏心脏右踝关节腔肝脏肺脏脊柱骨肌肉；120h时，肾脏放射性摄取％IDg最高2.78±0.44，其次是左踝关节腔肝脏右踝关节腔脊柱骨心脏肺脏肌肉；192h时，肾脏放射性摄取％IDg最高3.04±0.52，其次是左踝关节腔肝脏脊柱骨右踝关节腔心脏肺脏肌肉；360h时，肾脏放射性摄取％IDg最高2.70±0.54，其次是左踝关节腔脊柱骨肝脏右踝关节腔心脏肺脏肌肉。关节炎模型大鼠左踝关节腔注射89Zr-HM-3后，心脏、肺脏在1h时放射性摄取％IDg分别为0.59±0.94、0.25±0.42，在24h时放射性摄取％IDg最高，分别为1.15±0.14、0.71±0.39，然后随着时间的延长逐渐降低；左踝关节腔在1h时放射性摄取％IDg最高42.20±17.33，然后随着时间的延长逐渐降低，在360h时最低1.69±0.29；右踝关节腔、肌肉在1h时放射性摄取％IDg最低，分别为0.11±0.18、0.06±0.10，在48h时最高，分别为0.73±0.05、0.19±0.03，然后随着时间的延长逐渐降低；肝脏在1h时放射性摄取％IDg最低0.40±0.65，在24h时放射性摄取％IDg最高0.88±0.21，然后随着时间的延长轻微降低；肾脏在1h时放射性摄取％IDg最低0.39±0.57，192h时最高3.04±0.52，然后随着时间的延长逐渐降低；脊柱骨在1h时放射性摄取％IDg最低0.10±0.17，然后随着时间的延长逐渐增加，在360h时最高0.82±0.13。具体结果见图28。表19关节炎模型大鼠皮下注射游离89Zr后6个时间点放射性摄取％IDg如表19所示，2h时，心脏放射性％IDg最高1.08，其次是肾脏肝脏＝脊柱骨肺脏右踝关节腔肌肉左踝关节腔；12h、24h、48h、120h、192h时，脊柱骨放射性％IDg均最高，分别为2.43、3.64、4.05、5.35、5.38，均远高于相同时间点其他组织。3.伽马计数实验表20关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后分别在48h、120h时间点采集组织放射性摄取％IDg如表20所示，关节炎模型大鼠皮下注射89Zr-HM-3后48h时采集全血和组织，全血放射性摄取％IDg最高2.32±0.20，其次是肺脏肾脏性腺肝脏脾脏心脏肠脊柱骨关节腔液胰腺胃肌肉；实验动物皮下注射89Zr-HM-3后120h时采集全血和组织，肾脏放射性摄取％IDg最高2.16±1.94，其次是全血肺脏性腺脾脏关节腔液肝脏肠脊柱骨胰腺心脏胃肌肉。具体结果见图29。4.结论实验结果显示，游离89Zr在给药12h后主要分布于骨骼，89Zr在12h、24h、48h、120h、196h时间点时骨骼中的放射性摄取％IDg远高于其他组织，表明89Zr-HM-3在关节炎模型大鼠体内基本比较稳定；脑在全部时间点放射性摄取％IDg均很低，接近或低于相同时间点肌肉放射性摄取％IDg，表明89Zr-HM-3不易透过血脑屏障。关节炎模型大鼠分别皮下注射、左踝关节腔注射89Zr-HM-3后，心脏放射性摄取在24h时均最高，然后随着时间的延长逐渐降低，踝关节腔非给药部位放射性摄取在48h时均最高，然后随着时间的延长逐渐降低，肾脏、肝脏的放射性摄取随着时间的延长逐渐升高或者维持较高的水平。表21关节炎模型大鼠分别皮下注射和左踝关节腔注射89Zr-HM-3后在心脏的半衰期h如表21所示，通过DAS3.2.8软件非房室模型分析89Zr-HM-3经皮下注射关节炎模型大鼠的半衰期为120.68±31.99h；89Zr-HM-3经左踝关节腔注射关节炎模型大鼠的半衰期为98.35±36.83h。实施例14：HM-3融合蛋白TSL-4对双氧水损伤的骨组织细胞保护作用1、实验方法所有细胞实验均在无菌的生物安全柜内进行操作，操作平台在使用前后都要进行无菌UV照射和75％医用酒精处理，细胞废液要收集在废液桶，实验中用到的废弃移液管和移液枪头投放到高压灭菌袋内进行后期高压灭菌消毒。软骨细胞在T75培养瓶培养3-4天。当融合度达到80％后，移去原培养液，加入无菌PBS清洗细胞2-3次，然后加入适量的消化液，待细胞脱壁之后再加入新鲜培养液。离心移去含有消化液的细胞液，再加入适量的新鲜培养液配成适宜浓度的细胞悬浮液，用于细胞传代或细胞实验。细胞传代从P1代开始，直至P5代结束，每代都有冻存保留。细胞代数为P2-P5用于细胞实验。按照200μL孔的接种量，将密度为2.5*104个mL的细胞悬浮液接种在96孔细胞培养板里，共配制3组，一组为对照组，另两组给予双氧水刺激。另配不含细胞的培养液作为空白组。每组配4-5个副孔。将细胞培养板放置于培养箱孵育24小时。第二天将培养液替换为不同实验组，每组给药体积为100μl，分别孵育24或48小时。按实验计划结束孵育后，每个实验组按照细胞培养体积的110分别加入10μL的5mgmlMTT,让细胞跟MTT在培养箱孵育4小时。之后小心弃上清液，接着加入200μL二甲基亚砜DMSO，混匀后在酶标仪上以试验波长为570nm测定吸光度。细胞相对活性比率％计算公式：实验组的吸光度每孔对照组吸光度平均值再乘以100％。所有实验组均以均数±标准差表示。每组之间的差异用Prism7.0软件分析，one-wayANOVA检验。*P申请人：天士力医药集团股份有限公司一种HM-3融合蛋白及其应用201789DNA人工序列1gctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccggggga60ccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccct120gaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactgg180tacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaac240agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaag300gagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctcc360aaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggag420atgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc480gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg540ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtgg600caggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacaca660cagaagagcctctccctgtctctgggtggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggc720ggcggcggcagcatcgtccgccgcgcggaccgcgcggcggtcccgggcggcggcggccgc780ggcgactga7892858DNA人工序列gccaccatggcatgccctggcttcctgtgggcacttgtgatctccacctgtcttgaattt60agcatggctgctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggcc120gccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcc180cggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccag240ttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag300cagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg360aacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaa420accatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcc480caggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctacccc540agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg600cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaag660agcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac720cactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtggcggcggcggcagcggcggcggc780ggcagcggcggcggcggcagcatcgtccgccgcgcggaccgcgcggcggtcccgggcggc840ggcggccgcggcgactga8583PRO人工序列3IleValArgArgAlaAspArgAlaAlaValProGlyGlyGlyGlyArg151015GlyAsp4232PRTHomosapiens4GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAla151015ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro202530LysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValVal354045ValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrVal505560AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGln65707580TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGln859095AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAla100105110LeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnPro115120125ArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThr130135140LysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer145150155160AspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyr165170175LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr180185190SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe195200205SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLys210215220SerLeuSerLeuSerProGlyLys2252305228PRTHomosapiens5GluArgLysCysCysValGluCysProProCysProAlaProProVal151015AlaGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeu202530MetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSer354045HisGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGlu505560ValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThr65707580PheArgValValSerValLeuThrValValHisGlnAspTrpLeuAsn859095GlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeuProAlaPro100105110IleGluLysThrIleSerLysThrLysGlyGlnProArgGluProGln115120125ValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnVal130135140SerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleSerVal145150155160GluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrPro165170175ProMetLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThr180185190ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerVal195200205MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu210215220SerProGlyLys2256279PRTHomosapiens6GluLeuLysThrProLeuGlyAspThrThrHisThrCysProArgCys151015ProGluProLysSerCysAspThrProProProCysProArgCysPro202530GluProLysSerCysAspThrProProProCysProArgCysProGlu354045ProLysSerCysAspThrProProProCysProArgCysProAlaPro505560GluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys65707580AspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValVal859095AspValSerHisGluAspProGluValGlnPheLysTrpTyrValAsp100105110GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyr115120125AsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAsp130135140TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu145150155160ProAlaProIleGluLysThrIleSerLysThrLysGlyGlnProArg165170175GluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLys180185190AsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsp195200205IleAlaValGluTrpGluSerSerGlyGlnProGluAsnAsnTyrAsn210215220ThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSer225230235240LysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnIlePheSer245250255CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnArgPheThrGlnLysSer260265270LeuSerLeuSerProGlyLys2757229PRTHomosapiens7GluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysProAlaProGluPhe151015LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr202530LeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal354045SerGlnGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyVal505560GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSer65707580ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu859095AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeuProSer100105110SerIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro115120125GlnValTyrThrLeuProProSerGlnGluGluMetThrLysAsnGln130135140ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAla145150155160ValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr165170175ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerArgLeu180185190ThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGlyAsnValPheSerCysSer195200205ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer210215220LeuSerLeuGlyLys2258229PRTArtificialSequence8AlaGluSerLysTyrGlyProProCysProProCysProAlaProGlu151015AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp202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权利要求：1.一种融合蛋白，由活性多肽HM-3与人源IgG-Fc片段或IgG-Fc突变体片段连接形成，连接方式为：HM-3通过连接肽或直接与人源IgG-Fc片段或IgG-Fc突变体片段N端连接，或与C端连接，或C、N端同时连接，其通式为HM-3n-Linker-IgG-Fc、IgG-Fc-Linker-HM-3n、或HM-3n-Linker-IgG-Fc-Linker-HM-3n；其中n选自1，2，3，4或5。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽选自：①、GGGGSa，其中a为1，2，3，4，5或6；②、AEAAAKbA，其中b为1，2，3，4，5或6；③、APc，其中c为1至18；④、Gd，其中d为1至15。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽为GGGGSa序列，重复数a选自：3，4或5。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的IgG-Fc序列为人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc或其突变体。5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自：TSL-1融合蛋白：HM-3-GGGGS3-IgG2-Fc；TSL-2融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc；TSL-3融合蛋白：IgG2-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-4融合蛋白：mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-13融合蛋白：HM-3-GGGGS3-mIgG4-Fc-GGGGS3-HM-3；TSL-14融合蛋白：HM-3-HyFc；TSL-15融合蛋白：mIgG4-Fc-G5-HM-3-G8-HM-3；TSL-16融合蛋白：HyFc-GGGGS3-HM-3；TSL-17融合蛋白：mIgG4-Fc-AEAAAK4A-HM-3；TSL-18融合蛋白：mIgG4-Fc-AP9-HM-3。6.根据权利要求1-5任一项权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，采用基因重组技术制备，其中采用的表达细胞选自：酵母、CHO、SP20、BHK和或HEK293。7.含有权利要求1所述融合蛋白的药物组合物，所述药物组合物以适合药用的制剂形式存在，所述制剂形式选自：注射剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、或气雾剂，给药方式包括口服、静脉注射、静脉滴注、皮下或肌肉注射。8.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病，治疗新生血管疾病，治疗骨关节炎的药物中的应用。9.权利要求8所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。10.权利要求8所述新生血管疾病为湿性老年黄斑变性。

百度查询： 天士力生物医药股份有限公司 一种HM-3融合蛋白及其应用

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