申请/专利权人：广州医科大学附属第三医院;广州达安基因股份有限公司

申请日：2019-06-19

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN110229899B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12N15/113;C12N15/11;C40B40/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2021.07.27#著录事项变更;2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.13#公开

摘要：本发明公开了用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。具体地，本发明获得了在结直肠癌血浆中明显异常表达的miRNA，即miR‑224‑5p、miR‑301a‑3p、miR‑145‑5p、miR‑193b‑3p和miR‑1183。本发明通过研究这些血浆miRNA在各期结直肠癌患者、结直肠腺瘤患者及健康人群中的表达差异，发现该血浆miRNA组合能够作为结直肠癌早期诊断或预后判断标记物。

主权项：1.血浆中miRNA检测试剂的用途，其特征在于，用于制备鉴别结直肠腺瘤和结直肠癌的试剂盒，所述miRNA由miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和miR-1183组成；当所测定的样本中，与结直肠腺瘤样本相比，miR-224-5p水平显著提高；miR-301a-3p水平显著降低；miR-193b-3p水平显著提高；miR-145-5p水平显著降低；miR-1183水平显著提高；则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。

全文数据：用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合技术领域本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。背景技术结直肠癌colorectalcancer，CRC是最常见的恶性肿瘤之一，从全球范围看CRC发病率女性排第二位，男性排第三位，总体CRC死亡率排名第二。据估计，2018年将有180万新结直肠癌病例和881,000人死亡，约占癌症病例和死亡人数的1％。到2030年,全球CRC发病率预计将增加60％。2015年中国癌症统计数据表示男性CRC发病率居第五位，女性居第四位，总的发病率及死亡率均位于第五位，消化道肿瘤总体发病率逐年攀升。据文献统计，早期CRC规范治疗后,5年生存期可达90％，但仍有15％～20％的CRC在诊断时就已发现肝转移，其余60％亦在后续的治疗过程中发现复发或转移。CRC治疗的关键在于早筛早诊早治，在CRC在腺瘤阶段筛查出来并及时治疗是提高CRC患者生存率的有效方式。80％的结直肠癌是由腺瘤样息肉演变而来，癌变前有10～15年的良性肿瘤发展阶段，该时间窗为结直肠癌预防和早期诊断提供了有力时机，该特性也让结直肠癌成为为数不多的可以通过早期筛查减低发病率和死亡率的恶性肿瘤。通过结直肠癌筛查识别并切除腺瘤可降低大肠癌的发病率达53％。在这个阶段，手术方法几乎可以达到治愈疾病的效果，把握腺瘤恶变的时间,识别早期病变是结直肠癌诊治的关键第一步。然而，只有约59％的在超过50岁以后才接受结肠镜检查。另外，60％～70％的大肠癌患者被发现时已是Ⅱ期或晚期。与治疗相关的不良反应和不良预后导致CRC容易复发和转移。化疗耐药是晚期CRC治疗的一大障碍，而远处转移和局部复发是CRC患者术后死亡的主要原因。了解与CRC生存率相关的危险因素，有助于筛选易复发和转移的高危患者。肿瘤标志物可用于早期肿瘤患者的筛查，反映患者接受手术、放化疗或生物靶向治疗后的疗效、评估复发及远处转移情况，对于CRC的临床治疗、复发转移、预后评估有重要意义。目前用于结直肠癌的早期筛查手段有：粪便隐血检测化学法和免疫法、结肠镜检查、多靶点粪便检测、问卷风险评估、CT模拟结肠镜、粪便PKM2蛋白检测、血浆ctDNASept99甲基化检测等。粪便隐血检测化学法因敏感性差，采样时要求饮食方面的控制，结果受多因素干扰，Brenner等分析了近4万人筛查人群，对比结肠镜的结果，化学法粪检的漏诊率在进展期腺瘤和结直肠癌中分别高达90％和75％。所以现已不再被建议使用；免疫化学法FIT对结直肠癌筛查的敏感性为79％，特异性为94％。主要以胶体金试纸在筛查时最为广泛应用。实际应用中如能每年常规1次的免疫化学法FIT也能达到筛查目的。但其筛查的不足在于对进展期腺瘤的敏感性低，仅为20％～30％。此外，因粪便的采样问题导致弃检率高。结肠镜检查肠道病变检查最敏感的手段，可以直观整个肠壁情况，除了平坦型病变和罕见的“间期癌”较难发现外，大多息肉病变不易漏诊，总体看无症状的结肠镜下筛查人群病变检出率，在结直肠癌中可达0.5％～1.8％，在进展期腺瘤中高达14.8％，肠道息肉的总体检出率可高于13。但是结肠镜检查前需经过严格而痛苦的肠道准备，且技术要求高，创伤风险较高等因素很大程度上阻碍了结肠镜检查成为结直肠肿瘤早期筛查的首选工具，特别于我国医疗资源缺乏的现状来说，结肠镜作为初筛仍需慎重考虑。多靶点粪便检测利用粪便中肿瘤脱落细胞的DNA分子检测结合免疫法FIT，进一步提高了肠癌的筛检敏感性，对进展期腺瘤的筛检敏感性也能增强至54％。美国已经应用于无症状人群结直肠肿瘤早诊筛查，筛查周期推荐为1次1年或3年。这种方法的主要缺点就是价格较高。问卷风险评估筛查，即是询问并评估高危因素的存在，由浙江大学郑树教授团队提出，2007年被纳入国家卫计委癌症早诊早治的标准方案。这种方法最大优势是简单易行，提高了大众群体的筛查顺应率。但问卷中可评估因子风险影响度偏弱，对进展期结直肠肿瘤的筛查敏感性和特异性也不高。其他用于结直肠肿瘤早诊筛查的手段，因为存在各种缺陷也未被广泛推荐。综上所述，做到对结直肠癌高危人群的早发现，及时干预，临床上尚缺乏更为精准的预警手段或生物指标。发明概述本发明的目的是提供一种用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。本发明第一方面，提供了miRNA或其检测试剂的用途，用于制备结直肠癌早期诊断或预后预测的试剂盒，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p或其组合。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p；优选地，所述miRNA还包括miR-1183。在另一优选例中，所述的试剂盒含有miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、miR-1183、或其组合作为阳性对照。在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括血液血浆或组织。在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片、或其组合。在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。本发明第二方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于目标miRNA，所述目标miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：互补结合区；和或与固相载体相连的连接区。在另一优选例中，所述目标miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。在另一优选例中，所述目标miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有miRNA或其检测试剂，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合；并且，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中注明所述的试剂盒用于结直肠癌早期诊断或预后预测。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：当所测定的样本中miR-224-5p、miR-301a-3p和或miR-193b-3p的水平与健康样本的水平差异显著，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：当所测定的样本中，与健康样本相比，miR-224-5p水平显著提高；miR-301a-3p水平显著降低；和或miR-193b-3p水平显著提高；则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。在另一优选例中，所述的说明书记载一回归模型，建立logitP＝-1.052+86.495×miR-193b-3p+30.897×miR-224-5p–24.876×miR-301a-3p,其中miR-193b-3p、miR-224-5p、以及miR-301a-3p的表达水平以miR-30a-5p为内参测得，模型中logitP值显示检测样本与健康样本存在显著差异，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：当所测定的样本中miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和或miR-1183的水平与健康样本的水平差异显著，则提示该检测样本为结直肠肿瘤高危患者样本。在另一优选例中，当所测定的样本中，与健康样本相比，miR-224-5p水平显著提高；miR-301a-3p水平显著降低；miR-193b-3p水平显著提高；miR-145-5p水平显著降低；和或miR-1183水平显著降低或提高；则提示该检测样本为结直肠肿瘤高危患者样本。在另一优选例中，当所测定的样本中，与结直肠腺瘤样本相比，miR-224-5p水平显著提高；miR-301a-3p水平显著降低；miR-193b-3p水平显著提高；miR-145-5p水平显著降低；和或miR-1183水平显著提高；则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。在另一优选例中，所述的说明书记载一回归模型，建立logitP＝-2.338+7.166×miR-145-5p+173.161×miR-193b-3p-27.658×miR-1183+46.071×miR-224-5p–58.807×miR-301a-3p,其中miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183的表达水平以miR-30a-5p为内参测得，模型中logitP值显示检测样本与结直肠腺瘤样本存在显著差异，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。本发明第四方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：imiR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合，或ii与miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、或miR-193b-3p互补的miRNA，或其组合。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。在另一优选例中，所述miRNA包括miR-375-3p、miR-135b-5p、miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。在另一优选例中，所述miRNA选自下组：aSEQIDNO.:1-8任一所示的序列；b与SEQIDNO.:1-8任一所示序列互补的8个互补序列中的任一序列；或c来自a或b的组合，且来自a的序列与来自b的互补序列互相不为互补。本发明第五方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第四方面所述的miRNA。本发明第六方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第四方面所述的miRNA。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式I式I中，Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。在另一优选例中，所述测定是通过real-timePCR实现。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1：各miRNA在60例血浆样本中的表达情况，图中：1*表示P广州医科大学附属第三医院中山大学达安基因股份有限公司用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合00003425SIPOSequenceListing1.0123RNA人工序列Artificial1gcgacgagccccucgcacaaacc23222RNA人工序列Artificial2gugaaauguuuaggaccacuag22323RNA人工序列Artificial3uauggcuuuucauuccuauguga23425RNA人工序列Artificial4ucaagucacuagugguuccguuuag25522RNA人工序列Artificial5ucccugagacccuaacuuguga22623RNA人工序列Artificial6cagugcaauaguauugucaaagc23723RNA人工序列Artificial7guccaguuuucccaggaaucccu23822RNA人工序列Artificial8aacuggcccucaaagucccgcu22922RNA人工序列Artificial9uguaaacauccucgacuggaag221022RNA人工序列Artificial10uguaaacauccuugacuggaag221122RNA人工序列Artificial11uagcagcacguaaauauuggcg221227RNA人工序列Artificial12cacuguaggugauggugagagugggca271317DNA人工序列Artificial13tcgttcggctcgcgtga171425DNA人工序列Artificial14cggtgaaatgtttaggaccactaga251524DNA人工序列Artificial15cgtatggcttttcattcctatgtg241626DNA人工序列Artificial16tcaagtcactagtggttccgtttaga261724DNA人工序列Artificial17gtccctgagaccctaacttgtgaa241825DNA人工序列Artificial18gcagtgcaatagtattgtcaaagca251921DNA人工序列Artificial19ccagttttcccaggaatccct212019DNA人工序列Artificial20gccctcaaagtcccgctaa192124DNA人工序列Artificial21ctgtaaacatcctcgactggaaga242224DNA人工序列Artificial22cgtgtaaacatccttgactggaag242322DNA人工序列Artificial23tagcagcacgtaaatattggcg222420DNA人工序列Artificial24ggtgatggtgagagtgggca202524DNA人工序列Artificial25gctgtcaacgatacgctacgtaac24

权利要求：1.miRNA或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备结直肠癌早期诊断或预后预测的试剂盒，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p或其组合。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p；优选地，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p；优选地，所述miRNA还包括miR-1183。3.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于目标miRNA，所述目标miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有miRNA或其检测试剂，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合；并且，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中注明所述的试剂盒用于结直肠癌早期诊断或预后预测。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的说明书注明以下内容：当所测定的样本中miR-224-5p、miR-301a-3p和或miR-193b-3p的水平与健康样本的水平差异显著，则提示该检测样本为结直肠癌患者样本。8.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：imiR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合，或ii与miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、或miR-193b-3p互补的miRNA，或其组合。9.一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求8所述的miRNA。10.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求8所述的miRNA。

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