申请/专利权人：上海交通大学

申请日：2021-09-07

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN113817753B

主分类号：C12N15/50

分类号：C12N15/50;C07K14/165;C12N7/01;C12N15/86;A61K39/12;A61P31/14;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2022.01.07#实质审查的生效;2021.12.21#公开

摘要：本发明提供一种表达SARS‑CoV‑2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用；所述构建包括：敲除VSV负责识别宿主细胞受体的G蛋白基因，通过SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变异体SΔ21蛋白构建假型化VSV病毒；SΔ21为胞内区缺失21个氨基酸的S蛋白变异体。本发明构建的重组VSV病毒是针对SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白以及S蛋白羧基末端进行相应缺失后获得的S蛋白变异体，因此不涉及其活病毒，将不会产生生物安全问题；在本发明中，除了构建野生型M蛋白为骨架的VSV，还提出了全新的思路，即利用M蛋白构建的重组VSV病毒可用于疫苗的研制以及人、动物体内SARS‑CoV‑2病毒特异性中和抗体的检测。

主权项：1.一种表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，所述方法包括：敲除VSV负责识别宿主细胞受体的G蛋白基因，通过SARS-CoV-2变异体SΔ21蛋白构建假型化VSV病毒；SΔ21为胞内区缺失21个氨基酸的S蛋白变异体；编码所述SARS-CoV-2的S蛋白的序列如SEQIDNO.1所示；具体步骤如下：A1、重组质粒构建：a11、对SARS-CoV-2病毒S基因进行碱基敲除并获得优化的长度，获得S蛋白突变体SΔ21；所述S蛋白突变体SΔ21的序列如SEQIDNO.2所示；a12、构建克隆VSVIndiana株M三位点突变后的基因组序列的质粒pVSVMT；具体为构建基质蛋白M三个不同氨基酸位点发生了突变的VSV病毒质粒,包括基质蛋白第51位甲硫氨酸被敲除,第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸,即为质粒pVSVMT；a13、将SΔ21基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有MluI和XhoI酶切位点，经双酶切后分别克隆到pVSVMT质粒中，使SΔ21基因替换掉VSV中的G基因，分别获得重组质粒pVSVMT∆G-SΔ21；A2、病毒制备：a21、用痘病毒vTF7-3感染BHK21细胞，感染浓度为MOI=5，1-1.5小时后去除痘病毒；a22、将重组质粒pVSVMT∆G-SΔ21分别与辅助质粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L混合制备质粒转染混合液；a23、将质粒转染混合液共转染步骤a21的BHK21细胞；a24、用表达VSVG蛋白的质粒pVSV-G转染新鲜BHK21细胞，得BHK-G细胞；a25、收集步骤a23获得的细胞上清，滤去vTF7-3病毒，所得滤液加入到BHK-G细胞中进行扩增，2-3天后收集出现病变的细胞上清；a26、将步骤a25收集的细胞上清经空斑纯化后，后续用VeroE6细胞扩增、鉴定，得假型化VSV病毒。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海交通大学 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体S_Δ21的假型化VSV病毒构建和应用

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