申请/专利权人：江苏省家禽科学研究所

申请日：2021-03-17

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN112852799B

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2021.06.15#实质审查的生效;2021.05.28#公开

摘要：本发明涉及一种克隆鸡Smad4基因全序列的方法,对鸡多个组织分别提取总RNA反转录成cDNA，然后将得到的各个组织的cDNA混合成池；以NCBI上红色原鸡的Smad4基因的预测序列为参考序列，设计特异性引物；进行5’UTRRACE反应和3’UTRRACE反应；对smad4基因的cds区序列进行扩增；以上扩增序列产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收送测序公司测序；测序得到序列进行比对拼接，得到鸡Smad4基因的全序列。通过本发明，产生的效果为获得目的基因Smad4的序列全长（5’UTR、CDS、3’UTR）。

主权项：1.一种克隆鸡Smad4基因全序列的方法，其特征是，对鸡多个组织分别提取总RNA反转录成cDNA，然后将得到的各个组织的cDNA混合成池；以NCBI上红色原鸡的Smad4基因的预测序列为参考序列，设计特异性引物；进行5’UTRRACE反应和3’UTRRACE反应；对smad4基因的cds区序列进行扩增；以上扩增序列产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收送测序公司测序；测序得到序列进行比对拼接，得到鸡Smad4基因的全序列；具体包括以下步骤：一5-RACE-PCR实验；5-RACE模板采用GeneRacerTMKit进行合成；1.引物设计及序列采用PrimerPremier6.0软件进行5-RACE引物的设计，由生工生物工程上海股份有限公司进行合成；5-RACE引物名称及序列 2.5-RACEPCR反应体系及条件5-RACEPCR第一轮反应体系 表3：5-RACEPCR第一轮反应条件 5-RACEPCR第二轮反应体系 5-RACEPCR第二轮反应条件 3.5-RACEPCR电泳结果；PCR结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，5-RACEPCR呈现出一条特异性条带，大小约322bp左右，切胶回收后，连接pGM-T载体，转化高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程上海股份有限公司进行测序；二3-RACE-PCR实验；3-RACE模板采用GeneRacerTMKitInvitrogen，货号：L1500-01进行合成；1.引物设计及序列；采用PrimerPremier6.0软件进行3-RACE引物的设计，由生工生物工程上海股份有限公司进行合成；3-RACE引物名称及序列 2.3-RACEPCR反应体系及条件；3-RACEPCR第一轮反应体系 3-RACEPCR第一轮反应条件 3-RACEPCR第二轮反应体系 3-RACEPCR第二轮反应条件 3.3-RACEPCR电泳结果；PCR结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，3-RACEPCR呈现出一条特异性条带，大小约583bp左右，切胶回收后，连接pGM-T载体，转化高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程上海股份有限公司进行测序；三GallusSMAD4部分基因PCR扩增及回收；1.模板：CDNA为模板；2.引物序列引物名称及序列 3.PCR扩增体系及条件PCR扩增反应体系 PCR扩增反应条件 4.PCR扩增结果；PCR结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR产物呈现出一条特异性条带，切胶回收后，连接pGM-T载体，转化高效化学感受态；细胞DH5α，送往生工生物工程上海股份有限公司进行测序；四将一～三测序结果进行比对拼接获得鸡smad4基因全长如下：拼接序列如下：全长：2323bpCDS：17-1858bpCGCCTCGAGGTGACGCATGGCTCCGTGCCACGTCCTCGCCGTGCGCCGTCCCAGGGGGCCGCCGCGTCGCCGGTGCCAAACGGGGTCCGCGTCCCCCCCCGGCCGCCTCCGGCCCCGCTCGGGCGGCGGCTCCGTGCACGATGCTGAGCTCGGCCCCGCGCGGCGCCGGCCGTGCGGGCGTGGGGAGGGGGGCCGGAGGGTCCCCTGCAGCGGGGTGACGGGCAGGGCCGTGCCGTGCCGTGCCTTGCAGGGGAGCAGCGCCATGTCCCTGGGCGCGCCCAGCAGCAGCGACGCCTGCCTGAGCATCGTGCACAGCCTGATGTGCCACCGGCAGGGCGGGGAGAACGAGAGCTTCGCCAAGAGGGCCATCGAGAGCCTGGTCAAGAAGCTGAAGGAGAAGAAGGACGAGCTCGATTCGCTCATCGCCGCCATCACCACCAACGGCGCCCACCCCAGCAAGTGCGTCACCATCCAGCGCACCTTGGACGGGCGGCTCCAGGTGGCCGGCAGGAAGGGGTTCCCCCACGTCATCTATGCCCGGCTCTGGCGCTGGCCCGACCTGCACAAAAACGAACTGAAGCACTCCAAGTTCTGCCAGTTCGCCTTCGACCTCAAATACGACAGCGTCTGCGTCAACCCCTACCACTACGAGCGCGTGGTGGCCCCGGCCATCGGTCTGAGCATTCCCACCACAGATGGAGGTGCCACACGGGGCCAAGCGGGCGCCGTGCCCCCCCACCGAACCCTACCGCCCGCCGCTGCCCCCCCCCCGCAGCTCCCTGAGTCCCCCCACGTCCCCGGGAGCCTTTACCCCACGCTGCCCATTTCACCCCCAGCGGCCCCCGGCGGCTCCCTGCTCCCACTGCCCCACAGCGAGGGGCTGCTGCACATCTCCTGCCCCACACCTCCAGCGGCCGCACCGGCACAGCCCCCCCACAGAACGGCTTCCCAGCGCCCCCCAAGCCGCCCTACCACAGTTCACCAAACTGGAGTGGCAGCGCGGCCATCTACGCAGCCAACCTGGGGGGGTCGCAGCCCCCCCCCCAGCCCAGCGGCCGGAGCCACTCACAGCCCCCCCTGCACCACCCCAACCATTACTGGCCTCCACACCACAGCTCCACACCATACCAGCAACCCATATCCACCCACCCCGGGCCGGAATTCTGGTGCTCCATCGCCTACTTCGAGATGGACGTGCAGGTGGGGGAGATCTTCAAGGTGCCCTCCAGCTGCCCGCTGGTGGTCGTGGATGGTTATGTGGACCCCTCGGGGGGGGGACCGCTTCTGCCTGGGGCAGCTCTCCAACGTACACCGCACCGACGCCAGCGAGAGGGCCCGGCTGCACATCGGGAAGGGCGTGCAGTTGGAGTGCCGGGGGGAGGGCGATGTGTGGATGCGGTGTCTGAGCGACCACGCAGTGTTCGTGCAGAGTTATTACCTGGACCGTGAGGCCGGCAGAGCCCCCGGCGACGCCGTGCACAAAATCTACCCCGGAGCTCACATTAAGGTGTTTGACCTGCGGCAGTGCCACCGGCAGATGCAGCAGCAAGCAGCCACAGCCCACGCTGCTGCTGCCGCCCAGGCGGCCGCCGTGGCCGGAAACATCCCGGGACCCGGCGCGGTGGGCGGCATCGCTCCGGCCGTGGGGCTGTCGGCGGCGGCCGGGATCGGCGTGGATGATCTGCGGCGGCTGTGCATCCTCCGGCTGAGCTTCGTGAAGGGGTGGGGGCCGGACTACCCGCGGCAGAGCATCAAACACACGCCGTGTTGGATCGAGGTGCATCTGCACCGCGCGCTGCAGCTGCTGGATGAGGTCCTGCACGCCATTCCGGCCGCTGAGCCCGGAGCGCTGCGCTGAATGCGCTGCGGATGGGGGAGCAAAAGGGAAAAGGGGTGGAAGAAAAGGGGGTGGGGTGGGGAAAGAAGTGGGGGGGGATGTGAAAAAAAAGTGGGGGGGAAAGAAGAAAAAGTGGGGGGGGTGGAAAAAAAAAAATTGGGGGGGTGGAAAAAAAATAAAGGAGAAAAATGGGGAAAAAAAGGAGAAAGTGGAAAGAAAAAAATGAAGGGAAATGAAAGCGGGGAAAATAAAAGAAAGGGGAAAGTAAAAAGCGAGGAGGAAAATAAAGGGGAGAAATAAAGGGAAAAAGGGGAAAAAAGGAAAATAAAGGAAAAAAGTGGGAAAAATAAGGAGAAAATAAAGGGAAAATTAAAAAAGGGGGGGAGGAAAAAATTGGTTGATGTAATAAAATAATAACGTTTAAAAAAAAGTAAAAATAAAGTACAAAAATGAAAAGTACAGAAAGGAAGTGAAAAAAAAAAAAAA编码氨基酸序列如下：MAPCHVLAVRRPRGPPRRRCQTGSASPPGRLRPRSGGGSVHDAELGPARRRPCGRGEGGRRVPCSGVTGRAVPCRALQGSSAMSLGAPSSSDACLSIVHSLMCHRQGGENESFAKRAIESLVKKLKEKKDELDSLIAAITTNGAHPSKCVTIQRTLDGRLQVAGRKGFPHVIYARLWRWPDLHKNELKHSKFCQFAFDLKYDSVCVNPYHYERVVAPAIGLSIPTTDGGATRGQAGAVPPHRTLPPAAAPPPQLPESPHVPGSLYPTLPISPPAAPGGSLLPLPHSEGLLHISCPTPPAAAPAQPPHRTASQRPPSRPTTVHQTGVAARPSTQPTWGGRSPPPSPAAGATHSPPCTTPTITGLHTTAPHHTSNPYPPTPGRNSGAPSPTSRWTCRWGRSSRCPPAARWWSWMVMWTPRGGDRFCLGQLSNVHRTDASERARLHIGKGVQLECRGEGDVWMRCLSDHAVFVQSYYLDREAGRAPGDAVHKIYPGAHIKVFDLRQCHRQMQQQAATAHAAAAAQAAAVAGNIPGPGAVGGIAPAVGLSAAAGIGVDDLRRLCILRLSFVKGWGPDYPRQSIKHTPCWIEVHLHRALQLLDEVLHAIPAAEPGALR。

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百度查询： 江苏省家禽科学研究所 一种克隆鸡Smad4基因全序列的方法

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