申请/专利权人：南京启真基因工程有限公司

申请日：2021-02-25

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN114958761B

主分类号：C12N5/10

分类号：C12N5/10;C12N15/12;C12N15/53;C12N15/61;C12N15/113;C12N15/55;C12N15/85;C12N15/90;A01K67/0278;A61K49/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2022.09.16#实质审查的生效;2022.08.30#公开

摘要：本发明提供了一种表达人WNT1、COX‑2和或mPGES的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的胃癌模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，包括将编码人WNT1、COX‑2和或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQIDNO：14所示的WNT1、SEQIDNO：15所示的COX‑2和或SEQIDNO：16所示的mPGES的猪细胞和胃癌模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。

主权项：1.一种猪细胞的构建方法，其特征在于，将编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQIDNO：14所示的WNT1、SEQIDNO：15所示的COX-2和SEQIDNO：16所示的mPGES的猪细胞，所述的猪细胞为猪的体细胞，所述的编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为pK19，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点；所述的构建方法包括将安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至猪细胞；所述的安全港位点载体包含编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列以及安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：A）ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQIDNO：5所示，3’同源臂如SEQIDNO：6所示；B）AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQIDNO：7所示，3’同源臂如SEQIDNO：8所示；C）H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQIDNO：9所示，3’同源臂如SEQIDNO：10所示；或D）COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQIDNO：11所示，3’同源臂如SEQIDNO：12所示；所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：22所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：23所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO：25所示；所述的Cas载体包含编码Cas蛋白的核苷酸序列，所述的Cas蛋白为Cas9；所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号、核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 南京启真基因工程有限公司 一种胃癌模型猪的构建方法及应用

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