申请/专利权人：丹娜(天津)生物科技股份有限公司

申请日：2017-11-17

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN107765002B

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N33/558

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2024.03.22#著录事项变更;2020.08.07#著录事项变更;2018.03.30#实质审查的生效;2018.03.06#公开

摘要：本发明涉及一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，包括胶条，所述胶条包括顺次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中所述胶体金垫上包埋有金标记的隐球菌抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有隐球菌抗体作为检测线，包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线，所述胶体金免疫层析试纸条具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，能提供更准确可靠的检验结果。

主权项：1.一种隐球菌检测胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸条包括胶条，所述胶条包括顺次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；其中，所述胶体金垫上包埋有金标记的隐球菌抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有隐球菌抗体作为检测线，包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线；所述胶体金垫上还包括分离剂，所述分离剂为质量终浓度0.5％的酪蛋白；所述制备方法包括：抗体包被、胶体金垫的制备和胶体金试纸条的组装；所述抗体包被包括如下步骤：用抗体包被缓冲液稀释隐球菌抗体和抗胶体金上病毒抗体的抗体，得到质控线抗胶体金上病毒抗体的抗体稀释液和检测线隐球菌抗体稀释液，将所述抗胶体金上病毒抗体的抗体稀释液和所述隐球菌抗体稀释液使用喷金划膜仪分别划到硝酸纤维素膜上，干燥后密封保存；所述胶体金垫的制备包括如下步骤：1采用胶体金颗粒调节pH值，并加入分离剂，再加入隐球菌抗体静置；2向步骤1得到的胶体金溶液中加入封闭液进行封闭；3将步骤2封闭后的胶体金溶液离心去上清，采用复溶液复溶沉淀，得到隐球菌抗体标记液；4将步骤3的隐球菌抗体标记液喷涂到玻璃纤维膜上，烘干、密封得到所述胶体金垫；所述胶体金试纸条的组装包括如下步骤：将包被好的硝酸纤维素膜和样品垫、胶体金垫、吸水滤纸进行组装，组装后进行切割和干燥保存。

全文数据：一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，具体涉及一种用于检测隐球菌的胶体金免疫层析试纸条。背景技术[0002]隐球菌属在真菌分类学上归人半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科，引起人类感染的隐球菌主要是新型隐球菌和格特隐球菌。两种隐球菌的无性繁殖体均为无菌丝的单芽孢酵母样菌，在体外为无荚膜或仅有小荚膜，进入人体内后很快形成厚荚膜，有荚膜的隐球菌菌体直径明显增加，致病力明显增强。[0003]隐球菌Crytococcus是一种重要的条件致病菌，常感染免疫能力低下或免疫能力缺陷的患者，导致以中枢神经系统感染为主的深部真菌感染，病死率很高。美国疾病预防与控制中心CDC于1992-1993年进行的大系列流行病学研究显示，深部真菌感染的年发病率为178.3百万。其中，隐球菌病为65.5百万，约占36.7%。[0004]隐球菌可以感染人体的任何组织和脏器，最常见的部位是中枢神经系统，其次为肺部和皮肤。目前，在免疫抑制患者中，隐球菌感染的发病率约为5%〜10%，在AIDS患者中，隐球菌的感染率可以高达30%;而在免疫功能正常的人群中，隐球菌的感染率约为十万分之一左右。[0005]近年来由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素、肿瘤化疗、放疗和器官移植后免疫抑制剂的长期广泛应用，以及艾滋病的流行，隐球菌病明显增多。隐球菌性脑膜炎（以下简称“隐脑”）就是由隐球菌所致的最常见的中枢神经系统疾病，占隐球菌病的80%左右。隐脑的临床表现复杂，症状不典型，因而很难诊断，约80%的隐脑患者会被误诊为结核性脑膜炎。[0006]目前，临床上可采用脑脊液涂片墨汁染色、真菌培养以及隐球菌夹膜多糖抗原检测等方法对隐脑进行诊断。脑脊液涂片墨汁染色操作简单、用时短，但是其敏感性仅为50%-80%，易受到操作人员的主观影响;真菌培养和鉴定一般需要3天左右，其敏感性约为55%-80%。而隐球菌荚膜多糖®lucuronoxylomannan，GXM是引起病理变化的主要毒性因子。在菌体生长和繁殖过程中，GXM被不断分泌到胞外，通过免疫抑制作用和免疫调理作用从而影响宿主的免疫系统。隐球菌荚膜多糖抗原检测有耗时短、敏感度特异度高等特点。据文献报道，隐球菌荚膜多糖抗原检测具有高达90%以上的敏感性和特异性，已被多个专业指南列为隐脑的确诊依据，因此根据以上情况以及现在临床检测市场的需求，进行具有高灵敏度，高特异性、简单快速的免疫胶体金产品的开发具有其迫切性和必要性。[0007]目前国际上开展的隐球菌的检测方法主要有以下3大类：1印度墨汁染色法:该法敏感性差，阳性检出率很低，局限性大；2血培养或脑脊液培养等培养的方法:该法敏感性差，阳性检出率不高;3免疫学检测法:用特异性针对GXM的抗体实现对新型隐球菌的检测，检测血液和脑脊液的敏感性都能达到85%以上。[0008]免疫学检测方法的灵敏度和特异性都较前两种方法有明显的优势，正逐渐成为隐球菌检测的常用方法。免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术Enzyme-LinkedImmunosorbantAssay，ELISA、免疫焚光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中免疫胶体金技术具有操作简单、灵敏度高、检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。[0009]在新型隐球菌的临床检测中，目前国际市场上有为数不多的免疫检测产品，如：IMMY公司的乳胶凝集法产品和胶体金法产品，Bio-Rad公司的乳胶凝集法产品，Meridian公司的乳胶凝集法和ELISA法检测试剂盒产品。Meridian公司的ELISA试剂盒采用双抗夹心法，其方法是先将隐球菌的特异多克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本与多克隆抗体反应，37°C反应IOmin，再加入辣根过氧化物酶HRP标记的单克隆抗体，37°C反应IOmin，待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入显色底物显色，颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现GXM的检测。目前，我国国内并没有真正用于新型隐球菌临床检测的免疫学检测产品。[0010]现有技术中，CN105651996A公开了一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，包括GXM包被的酶标载体、抗GXM多克隆酶标抗体和GXM标准品，所述的GXM是从新型隐球菌培养液中提取纯化得到的，所述试剂盒先将GXM包被在酶标板上，再将待检样本或标准抗原与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点，再经酶与底物发生显色反应，根据测定结果计算待检抗原的浓度值，该专利采用的是免疫检测试剂盒进行检测，并没有公开是否可以用金免疫层析试纸条进行检测。CN103204927A公开了一种新型隐球菌单克隆抗体的制备方法，本发明涉及抗体及其制备方法与应用。具体而言，本发明涉及用于针对新型隐球菌荚膜多糖Glucuronoxylomannan，GXM抗原的一种小鼠IgG型单克隆抗体BE-A6和抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的单克隆抗体的制备方法及其在新型隐球菌抗原检测中的应用，该专利仅仅是给出了隐球菌单克隆抗体的制备方法，并没有给出隐球菌的检测方法。[0011]因此，在新型隐球菌临床检测领域内，迫切需要一种国内自主研发的检测GXM的免疫胶体金诊断试剂盒产品。发明内容[0012]本发明的目的在于，提供一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，所述胶体金免疫层析试纸条具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，能提供更准确可靠的检验结果。[0013]为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：[00M]—方面，本发明提供一种胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包括胶条，所述胶条包括顺次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中所述胶体金垫上包埋有金标记的隐球菌抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有隐球菌抗体作为检测线，包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线。[0015]本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条采用夹心法，若检测样本为阳性，其中的隐球菌荚膜多糖与胶体金标记的隐球菌抗体结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的隐球菌抗体反应，形成免疫复合物而呈现红色条带，游离金标记抗体则在质控线与羊抗鼠抗体结合显现红色条带;若检测样本为阴性，其中不含隐球菌荚膜多糖，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现条带，仅在质控线显色；质控线在检测阳性样本和阴性样本时均应出现条带，所显现的红色条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。[0016]根据本发明，所述金标记的隐球菌抗体的浓度为2-8ygmL，例如可以是2ygmL、3μgmL、4ygmL、5ygmL、6ygmL、7ygmL或8ygmL，优选为5ygmL〇[0017]作为本发明的优选技术方案，所述胶体金上病毒抗体为鼠源性抗体，所述作为质控线的抗体为羊抗鼠IgG。鼠源性抗体是目前商业化抗体中最常见的抗体形式，来源广泛，成本较低，并且特异性和稳定性好。所述病毒抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，制备所述多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，比如可以用相应病毒免疫动物，如鼠，从动物血清中纯化多克隆抗体，但是多克隆抗体相比单克隆抗体可能存在特异性不强的问题，有可能有假阳性结果的产生。具体到本发明，所述病毒抗体虽然可以采用多克隆抗体，但是单克隆抗体具有更明显的优势，因此是本发明的优选，制备所述单克隆抗体的方法比如可以是用相应病毒免疫动物，如鼠，取动物脾脏B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，从中获取特异性较强的单克隆抗体。[0018]根据本发明，所述硝酸纤维素膜上还包被有阻断剂作为阻断线，所述阻断线用于去除干扰，可以结合样本中存在干扰的物质，所述阻断剂为HAM阻断剂和或HBR阻断剂。[0019]优选地，所述HAMA阻断剂的浓度为0.5_2mgml，例如可以是0.5mgml、0.6mgml、0·7mgml、0·8mgml、0·9mgml、lmgml、I·2mgml、I·3mgml、I·5mgml、I·8mgml或2mgml〇[0020]优选地，所述HBR阻断剂的浓度为0·3-lmgml，例如可以是0·3·mgml、0·4mgml、0·5mgml、0·6mgml、0·7mgml、0·8mgml、0·9mgml或lmgml〇[0021]根据本发明，所述胶体金垫上还包括分离剂，所述分离剂为酪蛋白、BSA或PEG6000聚乙二醇6000中的任意一种或至少两种的组合，优选为酪蛋白。[0022]本发明中，发明人发现在胶体金垫上加入分离剂，使得隐球菌抗体与胶体金颗粒的结合更加稳定，进一步降低了金免疫层析试纸条的检测限，不仅如此，发明人意外发现，相比于BSA和PEG6000,采用所述酪蛋白作为分离剂时，金标物的复溶性和检测性能会进一步提升，最低检测限达到〇.5ngmL。[0023]根据本发明，所述酪蛋白的质量终浓度为0.1-1%，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为0.5%〇[0024]根据本发明，所BSA的质量终浓度为0.1-1%，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为0.1%。[0025]根据本发明，所述TOG6000的质量终浓度为0.1-1%，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为1%〇[0026]根据本发明，所述隐球菌抗体为抗隐球菌荚膜多糖抗原的单克隆抗体和或抗隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体，优选为抗隐球菌荚膜多糖抗原的单克隆抗体。[0027]优选地，所述隐球菌抗体的制备方法包括如下步骤:通过将隐球菌荚膜多糖抗原作为免疫原免疫动物得到的特异性细胞株，再将特异性细胞株免疫动物得到的腹水进行分离纯化后得到。[0028]优选地，所述纯化方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和或亲和层析法。[0029]根据本发明，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，优选为玻璃纤维膜。[0030]优选地，所述胶体金垫为玻璃纤维膜。[0031]优选地，所述胶体金免疫层析试纸条还包括底板，所述胶条设置在所述底板上。[0032]优选地，所述底板为聚氯乙烯胶板。[0033]第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括:抗体包被、胶体金垫的制备和胶体金试纸条的组装。[0034]本发明中，所示抗体包被为本领域的常规技术手段，在此不作特殊限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择和制备。[0035]优选地，所述抗体包被的抗体包被缓冲液为PBS缓冲液、PB缓冲液或CBS缓冲液碳酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。[0036]优选地，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0·01-0·3molL，例如可以是0·OlmolU0·02molL、0·03molL、0·05molL、0·08molL、0·lmolL、0·12molL、0·15molL、0·18molL、0·2molL、0·22molL、0·25molL、0·28molL或0·3molL，优选为0·01-0·2molL。[0037]优选地，所述PBS缓冲液的pH为6-8.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2或8.5，优选为7-8。[0038]优选地，所述PB缓冲液的摩尔浓度为0.01-0.1111〇11^，例如可以是0.01111〇11、0·02molL、0·03molL、0·04molL、0·05molL、0·06molL、0·07molL、0·08molL、0·09molL或0·lmolL，优选为0·01-0·05molL。[0039]优选地，所述PB缓冲液的pH为7-8,例如可以是7·1、7·2、7·3、7·4、7·5、7·6、7·7、7·8、7·9或8,优选为7.2-7.4。[0040]优选地，所述CBS缓冲液的摩尔浓度为0.01-0.lmolL，例如可以是0.01molL、0·02molL、0·03molL、0·04molL、0·05molL、0·06molL、0·07molL、0·08molL、0·09molL或0·lmolL，优选为0·03-0·05molL。[0041]优选地，所述CBS缓冲液的pH为8.5-9.8，例如可以是8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7或9.8，优选为9-9.5。[0042]根据本发明，所述胶体金垫的制备具体包括如下步骤：[0043]1采用胶体金颗粒调节pH值，并加入分离剂，再加入隐球菌抗体静置；[0044]2向步骤⑴得到的胶体金溶液中加入封闭液进行封闭；[0045]3将步骤2封闭后的胶体金溶液离心去上清，采用复溶液复溶沉淀，得到隐球菌抗体标记液；[0046]4将步骤3的隐球菌抗体标记液喷涂到玻璃纤维膜上，烘干、密封得到所述胶体金垫。[0047]根据本发明，步骤（1所述的胶体金颗粒的粒径为30-40nm，例如可以是30nm、3Inm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm或40nm〇[0048]优选地，步骤（I所述pH值为6-7,例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6·8、6·9或7,优选为6·3-6·5。[0049]优选地，步骤⑵所述的封闭液为酪蛋白和或BSA溶液。[0050]优选地，所述酪蛋白的质量浓度为0.1-4%，例如可以是0.I%、0.2%、0.3%、0·4%、0·5%、0·6%、0·8%、1%、1·2%、1·5%、1·6%、1·8%、2%、2·2%、2·3%、2·5%、2·8%、3%、3·2%、3·5%、3·8%或4%，优选为0.5-2%。[0051]优选地，所述BSA溶液的质量浓度为0.5-5%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.3%、2.5%、2.8%、3%、3.2%、3.5%、3·8%、4%、4·2%、4·3%、4·5%、4·8%或5%，优选为1-4%。[0052]优选地，步骤⑶所述复溶液为Tris、蔗糖、海藻糖和BSA中的任意一种或至少两种的混合。[0053]优选地，所述Tris的摩尔浓度为10-30mM，例如可以是10mM、12mM、15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或30mM，优选为20mM。[0054]优选地，所述蔗糖的质量浓度为5-15%，例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%，优选为10%。[0055]优选地，所述海藻糖的质量浓度为3-10%，例如可以是3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，优选为5%。[0056]优选地，所述BSA的质量浓度为0·1-5%，例如可以是0·1%、0·2%、0·3%、0·5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.3%、2.5%、2.8%、3%、3.2%、3.5%、3.8%、4%、4.2%、4.5%、4.8%或5%，优选为1%。[0057]优选地，所述复溶液的pH值为8-9,例如可以是8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9,优选为8.5。[0058]第三方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条。[0059]第四方面，本发明提供如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条和或如第三方面所述的检测试剂盒用于检测隐球菌。[0060]优选地，所述隐球菌包括隐球菌血清型A型、隐球菌血清型B型、隐球菌血清型C型或隐球菌血清型D型中的任意一种或至少两种的组合。[0061]本发明中，所示试纸条的使用方法具体如下：[0062]1吸取80μ1待检样本缓慢滴加于试纸条的加样孔中；[0063]2计时，15-20分钟读取结果，20分钟后结果可能出现异常。[0064]结果分析：[0065]阳性⑴：出现两条红色条带，一条位于检测线T，另一条位于质控线C，表示样本中存在隐球菌荚膜多糖。[0066]阴性㈠：仅质控线C出现一条红色条带，在检测线⑴无红色条带出现，表示样本中没有荚膜多糖或荚膜多糖低于检出水平。[0067]无效：质控线（C未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。[0068]注意：由于样本中荚膜多糖滴度的不同，检测线⑴的红色条带会显现出不同深浅的颜色。但是，本试剂的测试结果不能做为判定样本中荚膜多糖滴度高低的依据。[0069]第五方面，本发明提供如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条用于制备检测脑膜脑炎诊断试剂盒的用途。[0070]优选地，所述脑膜脑炎为隐球菌引起的脑膜脑炎。[0071]本发明中，隐球菌脑膜脑炎是最常见的真菌颅内感染从而导致的脑膜脑炎，本申请胶体金免疫层析试纸条通过检测隐球菌从而实现脑膜脑炎的检测。[0072]与现有技术相比，具有如下有益效果：[0073]1本发明所述胶体金免疫层析试纸条采用夹心法检测隐球菌，具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，检验结果准确可靠；[0074]2本发明所述胶体金免疫层析试纸条通过在胶体金垫添加分离剂，使得隐球菌抗体与胶体金颗粒的结合更加稳定，进一步降低了金免疫层析试纸条的检测限，最低检测限可达〇.5ngmL;[0075]3本发明所述胶体金免疫层析试纸条对于隐球菌A、B、C、D四种血清型菌株均有较高的灵敏度和特异性。附图说明[0076]图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的示意图，其中，1-样品垫，2-胶体金垫，3-阻断线，4-检测线T线），5_质控线C线），6_吸水滤纸，7-PVC底板，8-硝酸纤维素膜NC膜）。具体实施方式[0077]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。[0078]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。[0079]实施例中所用的试剂和仪器设备的来源：羊抗鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；硝酸纤维素膜购自默克密理博;三维平面划膜仪购自上海金标生物科技有限公司；切条机购自上海金标生物科技有限公司;PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜和卡壳购自上海金标生物科技有限公司。[0080]实施例1胶体金免疫层析试纸条的制备[0081]本发明胶体金免疫层析试纸条可按照下述方法制备，具体是指结构如图1所示：[0082]在聚氯乙烯PVC胶板上一端顺次相互搭接地贴上样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸，然后将PVC胶板及贴附的材料切成宽度为4±0.2mm的试纸条，并装入卡壳内，卡壳上开有加样区和显色区（观察区域）。[0083]其中，所述样品垫为玻璃纤维膜;其中所述胶体金垫上包埋有浓度为2-8ygmL的金标记的隐球菌抗体;所述硝酸纤维素膜包括:阻断线为HAMA阻断剂和HBR阻断剂的混合，所述HAMA阻断剂的浓度为lmgml，所述HBR阻断剂的浓度为0.8mgml，T线检测限）为隐球菌抗体的包被抗体，C线质控线为羊抗鼠IgG抗体。[0084]1隐球菌抗体的制备：[0085]通过将隐球菌荚膜多糖抗原作为免疫原免疫动物得到的特异性细胞株，再将特异性细胞株免疫动物得到的腹水进行分离纯化后得到；[0086]⑵抗体包被：[0087]①用包被缓冲液0.01-0.05molLpH为7.2-7.4的I3B稀释隐球菌抗体和羊抗鼠抗体至lmgml，得到C线羊抗鼠包被液、T线隐球菌抗体稀释液；[0088]②向步骤①得到的稀释液使用喷金划膜仪划到NC硝酸纤维素膜，按lyLcm的条件进行划线；[0089]③将步骤②NC膜置于烘箱37°C进行干燥4小时，干燥后加干燥剂密封保存；[0090]3胶体金垫的制备：[0091]①用胶体金颗粒调整pH值至6.5,向其中加入终浓度0.5%的酪蛋白分离剂，再加入隐球菌抗体至终浓度5ygml，静置60min;[0092]②向步骤①得到的胶体金溶液中加入10%BSA封闭液至终浓度到1%进行封闭60min；[0093]③将步骤②得到的胶体金溶液使用4°C8000r进行离心40min，离心后去上清，使用复溶液复溶沉淀，得到隐球菌抗体标记液；[0094]④将步骤③得到的隐球菌抗体标记液使用喷金划膜仪按15ylcm进行喷涂到玻璃纤维膜上；[0095]⑤将步骤④中的玻璃纤维膜烘箱37°C进行干燥180min，干燥后加干燥剂密封保存，即得到金标垫；[0096]⑷胶体金试纸条的组装：[0097]①将包被好的NC膜和金标垫与吸水纸、样品垫在PVC板上进行组装；[0098]②向步骤①得到的组装板用切条设备切成4+0.2_的胶体金试纸条；[0099]③将步骤②中得到的试纸条置于密封袋中加干燥剂保存。[0100]如图1所示，本发明的胶体金免疫层析试纸条的检测原理，具体如下：[0101]在加样区（样品垫加入被检测样品后，通过毛细作用，检测隐球菌的区域中：样品中抗原-抗体-胶体金的结合物向吸水纸一端的方向移动。如果被检测样品中含有该隐球菌荚膜多糖的抗原，样品移动到T线即胶体金标记的隐球菌抗体的包被抗体的包被线时，抗原-抗体-胶体金的结合物被捕获，在T线处生成抗体-抗原-抗体-胶体金的结合物，因此显示一条红色条带;样品继续流动，流动到C线即羊抗鼠IgG抗体时，会出现一条红色条带，证明该试纸条的有效性。若检测的实际样品中不存在隐球菌荚膜多糖的抗原，不会形成免疫复合物，则在T线处不会显示红色条带，仅在C线显色。只要C线不显色，证明该试纸条无效，需要重新检测实际样品。[0102]下面通过实施例说明本发明的胶体金免疫层析试纸条的制备和检测。应当理解这些实施例仅是示例性的，不应当限制本发明的保护范围。[0103]实施例2:胶体金免疫层析试纸条的制备[0104]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.1%的酪蛋白。[0105]实施例3:胶体金免疫层析试纸条的制备[0106]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.25%的酪蛋白。[0107]实施例4:胶体金免疫层析试纸条的制备[0108]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为1%的酪蛋白。[0109]实施例5:胶体金免疫层析试纸条的制备[0110]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.1%的BSA。[0111]实施例6:胶体金免疫层析试纸条的制备[0112]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.25%的BSA。[0113]实施例7:胶体金免疫层析试纸条的制备[0114]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.5%的BSA。[0115]实施例8:胶体金免疫层析试纸条的制备[0116]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为1%的BSA。[0117]实施例9:胶体金免疫层析试纸条的制备[0118]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.1%的PEG6000。[0119]实施例10:胶体金免疫层析试纸条的制备[0120]与实施例1相比，胶体金垫的制备中：所示分离剂为0.25%的PEG6000。[0121]实施例11:胶体金免疫层析试纸条的制备[0122]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为0.5%的PEG6000。[0123]实施例12:胶体金免疫层析试纸条的制备[0124]与实施例1相比，胶体金垫的制备中:所示分离剂为1%的PEG6000。[0125]实施例13:胶体金免疫层析试纸条的制备[0126]与实施例1相比，抗体包被采用pH7.0-8.0的0.01-0.20molL的I3BS缓冲溶液;胶体金垫的制备中：用胶体金颗粒调整pH值至6，封闭液加入至终浓度为4%的BSA进行封闭。[0127]实施例14:胶体金免疫层析试纸条的制备[0128]与实施例1相比，抗体包被采用pH9.0.0-9.5的0.05moVL的CBS缓冲液;胶体金垫的制备中：用胶体金颗粒调整PH值至7,封闭液加入至终浓度为0.5-2%的酪蛋白进行封闭。[0129]对比例1:胶体金免疫层析试纸条的制备[0130]与实施例1相比，胶体金垫的制备中不添加分离剂。[0131]实施例15胶体金免疫层析试纸条检测[0132]将实施例1-13和对比例1中的胶体金免疫层析试纸条用于检测，具体步骤如下：[0133]⑴吸取80μ1菌液3组缓慢滴加于试纸条的加样孔中；[0134]2计时，15-20分钟读取结果，20分钟后观察结果，结果如表1所示：[0135]表1不同稳定剂对胶体金标记抗体的影响[0136][0137]检测限的计算:对抗原进行具体浓度的稀释，将检测抗原稀释0.1、0.25、0.5、1、2、4、8ngml，使用不同的分离剂制备的试纸进行检测，重复3次，均能出检测线的最低浓度即为检测限。[0138]从表1可以看出，不采用分离剂，其检测限在3-5ngmL，而用BSA做分离剂，虽然金标物的复溶性比较好，但能显著降低试剂的灵敏度；用PEG6000做分离剂，金标物的复溶性良好，但容易造成试剂假阳性，而用终浓度为0.5%的酪蛋白做分离剂，金标物的复溶性和试剂检测性能均良好，检测限低至0.5ngmL，故选择0.5%的BSA作为胶体金标记抗体的分离剂。[0139]实施例16:隐球菌荚膜多糖免疫层析试纸条检测不同血清型菌体[0140]1将4种不同血清型的菌液用生理盐水梯度稀释；[0141]2使用实施例1中制备的胶体金试纸条检测上述菌液，结果如表2所示。[0142]表2试纸条检测菌液结果[0143][0144]从表2的结果可以看出，该胶体金试纸对于4种血清型均有较高的灵敏度，特别是针对A血清型的菌种灵敏度特别高。[0145]综上所述，本发明所述胶体金免疫层析试纸条采用夹心法检测隐球菌，通过在胶体金垫添加分离剂，使得隐球菌抗体与胶体金颗粒的结合更加稳定，进一步降低了金免疫层析试纸条的检测限，最低检测限可达〇.5ngmL;本发明所述胶体金免疫层析试纸条具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，检验结果准确可靠，对于隐球菌A、B、C、D四种血清型菌株均有较高的灵敏度和特异性。[0146]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

权利要求：1.一种胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包括胶条，所述胶条包括顺次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中所述胶体金垫上包埋有金标记的隐球菌抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有隐球菌抗体作为检测线，包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线。2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述金标记的隐球菌抗体的浓度为2-8ygmL，优选为5ygmL;优选地，所述胶体金上病毒抗体为鼠源性抗体，所述作为质控线的抗体为羊抗鼠IgG;优选地，所述硝酸纤维素膜上还包被有阻断剂作为阻断线；优选地，所述阻断剂为HAM阻断剂和或HBR阻断剂；优选地，所述HAM阻断剂的浓度为0.5-2mgml;优选地，所述HBR阻断剂的浓度为0.3-lmgml。3.根据权利要求1或2所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金垫上还包括分离剂；优选地，所述分离剂为酪蛋白、BSA或PEG6000中的任意一种或至少两种的组合，优选为酷蛋白；优选地，所述酪蛋白的质量终浓度为0.1-1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为0.5%；优选地，所BSA的质量终浓度为0.1-1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为0.1%;优选地，所述PEG6000的质量终浓度为0.1-1%，优选为0.25-0.8%，进一步优选为1%。4.根据权利要求1-3中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述隐球菌抗体为抗隐球菌荚膜多糖抗原的单克隆抗体和或抗隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体，优选为抗隐球菌荚膜多糖抗原的单克隆抗体；优选地，所述隐球菌抗体的制备方法包括如下步骤:通过将隐球菌荚膜多糖抗原作为免疫原免疫动物得到的特异性细胞株，再将特异性细胞株免疫动物得到的腹水进行分离纯化后得到；优选地，所述纯化方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和或亲和层析法。5.根据权利要求1-4中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，优选为玻璃纤维膜；优选地，所述胶体金垫为玻璃纤维膜；优选地，所述胶体金免疫层析试纸条还包括底板，所述胶条设置在所述底板上；优选地，所述底板为聚氯乙烯胶板。6.—种如权利要求1-5中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括:抗体包被、胶体金垫的制备和胶体金试纸条的组装；优选地，所述抗体包被的抗体包被缓冲液为I3BS缓冲液、I3B缓冲液或CBS缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0·01-0·3molL，优选为0·01-0·2molL;优选地，所述PBS缓冲液的pH为6-8.5，优选为7-8;优选地，所述PB缓冲液的摩尔浓度为0·01-0·lmolL，优选为0·01-0·05molL;优选地，所述PB缓冲液的pH为7-8，优选为7.2-7.4;优选地，所述CBS缓冲液的摩尔浓度为O·01-0·lmolL，优选为O·03-0·05molL;优选地，所述CBS缓冲液的pH为8.5-9.8，优选为9-9.5。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金垫的制备具体包括如下步骤：1采用胶体金颗粒调节pH值，并加入分离剂，再加入隐球菌抗体静置；⑵向步骤⑴得到的胶体金溶液中加入封闭液进行封闭；3将步骤2封闭后的胶体金溶液离心去上清，采用复溶液复溶沉淀，得到隐球菌抗体标记液；4将步骤3的隐球菌抗体标记液喷涂到玻璃纤维膜上，烘干、密封得到所述胶体金垫；优选地，步骤⑴所述的胶体金颗粒的粒径为30-40nm;优选地，步骤⑴所述pH值为6-7，优选为6.3-6.5;优选地，步骤⑵所述的封闭液为酪蛋白和或BSA溶液；优选地，所述酪蛋白的质量浓度为0.1-4%，优选为0.5-2%;优选地，所述BSA溶液的质量浓度为0.5-5%，优选为1-4%;优选地，步骤3所述复溶液为Tris、蔗糖、海藻糖和BSA中的任意一种或至少两种的混合；优选地，所述Tris的摩尔浓度为10-30mM，优选为20mM;优选地，所述蔗糖的质量浓度为5-15%，优选为10%;优选地，所述海藻糖的质量浓度为3-10%，优选为5%;优选地，所述BSA的质量浓度为0.1-5%，优选为1%;优选地，所述复溶液的pH值为8-9，优选为8.5。8.—种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条。9.如权利要求1-5中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条和或如权利要求8所述的检测试剂盒用于检测隐球菌；优选地，所述隐球菌包括隐球菌血清型A型、隐球菌血清型B型、隐球菌血清型C型或隐球菌血清型D型中的任意一种或至少两种的组合。10.如权利要求1-5中任一项所述的胶体金免疫层析试纸条用于制备检测脑膜脑炎诊断试剂盒的用途；优选地，所述脑膜脑炎为隐球菌引起的脑膜脑炎。

百度查询： 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

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