申请/专利权人：扬州大学

申请日：2021-12-31

公开（公告）日：2024-04-16

公开（公告）号：CN114410494B

主分类号：C12N1/19

分类号：C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12P7/62;C12R1/865

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.16#授权;2022.05.20#实质审查的生效;2022.04.29#公开

摘要：本发明公开了一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，所述酿酒酵母工程菌，其以酿酒酵母芳香族氨基酸途径为基础，在已有整合了前体咖啡酸的合成所需的三个外源基因的前提上，继续整合了OD‑LDHY52A基因、OPc4CL2基因和OMoRAS基因，通过对细胞内限制前体合成的步骤的调控，能够获得稳定高产的酿酒酵母工程菌，实现葡萄糖到迷迭香酸的一步合成，无需添加其它外源前体物质；此外，通过敲除酿酒酵母苯丙氨酸合成所需要的PHA2基因，能够使得酿酒酵母工程菌在发酵中减少副产物的积累，以提高酿酒酵母重组菌株前体物质供应；通过将OPc4CL2基因的GAL10启动子替换为DDI2启动子，能够提高咖啡酰辅酶A合成酶和迷迭香酸合成酶对前体丹参素和咖啡酸的利用效率。

主权项：1.一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌在基因组中整合了OD-LDHY52A基因、OPc4CL2基因和OMoRAS基因，并敲除了PHA2基因；所述OD-LDHY52A基因的碱基序列如SEQIDNO：1所示，所述OPc4CL2基因的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述OMoRAS基因的碱基序列如SEQIDNO：3所示；所述OD-LDHY52A基因对应的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述OPc4CL2基因对应的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，所述OMoRAS基因对应的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示；所述OPc4CL2基因的GAL10启动子被替换为DDI2启动子，所述DDI2启动子的基因序列如SEQIDNO：7所示；所述构建方法包括如下步骤：重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A和pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒的获得；将重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，得到YCA-SSA-5B菌株；将酿酒酵母YCA-SSA-5B中的URA3和KanMX基因丢失，并敲除PHA2基因，得到YCA-SSA-9B-菌株；将pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒导入YCA-SSA-9B-中，得到YRA113-10B菌株；所述重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A的构建步骤包括：利用引物UPPDC5-F：AAAGCTGGAGCTGGCCTTGTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTG、UPPDC5-R：CTTACATCTTATTTAGAATAGGCCTTTATGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAAC和DNPDC5-F：GTTATTTGCTTTATTTCCTTGGCCATAAAGGCCTATTCTAAATAAGATGTAAGGCC、DNPDC5-R：TAATAGCGAAGAGGCCTACAGCTAATTAACATAAAACTCATG，分别从酿酒酵母BY4741的基因组上扩增出497bp的UpPDC5同源臂和500bp的DnPDC5同源臂，所述497bp的UpPDC5同源臂位置为ChrⅫ:410219到410720；所述500bp的DnPDC5同源臂位置为ChrIV:412414到412987；以上述两个片段为模板，UPPDC5-FDNPDC5-R为引物，采用融合PCR技术扩增出HAPDC5同源臂片段；利用引物PUMRI-PDC5-F：AATACAATAACAAGAAGAACACAAGGCCAGCTCCAGCT、PUMRI-PDC5-R：TGAGTTTTATGTTAATTAGCTGTAGGCCTCTTCGCTATTA，以PUMRI-11为模板扩增出质粒骨架大片段；以该大片段和同源臂片段互为引物，互为模板，采用融合PCR技术扩增出质粒PUMRI-△PDC5；所述PUMRI-11的序列为GenBank:KM216413.1；以密码子优化后合成的基因OD-LDH为模板，用带有BamHI识别位点的识别序列引物OD-LDH-F、OD-LDHY52A-R：GTGTAGTCCTTTTGTTGagcAACGTCAGCACCGTCGAAAC和带有SalI识别位点的识别序列引物OD-LDHY52A-F：TCGACGGTGCTGACGTTgctCAACAAAAGGACTACACTGC、OD-LDH-R，通过融合PCR扩增得到突变基因OD-LDHY52A；将突变基因用BamHI和SalI双酶切，得到的片段与同样BamHI和SalI双酶切的pUMRI-△PDC5质粒连接做转化，构建得到pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A质粒；所述的pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒构建方法包括：用带有EcoRI识别位点的识别序列引物PDDI2-F：GCGGAATTCGATTGATTCTTTTGAAGAGAAGCA、PGAL1-DDI2-R：AGTGCGGCGCGAGGCACATTCAAAGGTTAAACTCGCTTAGA和带有SmaI识别位点的识别序列引物PDDI2-GAL1-F：TAGTCTAAGCGAGTTTAACCTTTGAATGTGCCTCGCGCCGCACT、PGAL1-R：TCCCCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGT，以BY4741基因组为模板，通过两轮PCR，构建双向启动子PGAL1-PDDI2，并用EcoRI和SmaI进行双酶切，与同样双酶切的PUMRI-15进行连接转化，得到PUMRI-30质粒；将OPc4CL2用EcoRI和SacI进行双酶切，得到的片段与EcoRI和SacI双酶切的pUMRI-30质粒按照进行连接转化，构建得到pUMRI-30-OPc4CL2质粒；OMoRAS用SmaI和SalI进行双酶切，得到的片段与SmaI和XhoI双酶切的pUMRI-30-OPc4CL2的质粒进行连接转化，分别构建得到pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒。

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百度查询： 扬州大学 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

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