申请/专利权人：中山大学孙逸仙纪念医院

申请日：2023-09-28

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN117343892B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/0775;C12N5/078;C12Q1/02;A61K35/26;A61P35/00;A61P37/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2024.01.23#实质审查的生效;2024.01.05#公开

摘要：本发明公开了一种人工淋巴结原基的构建方法及应用。所述构建方法包含以下步骤：S1：制备永生化的脾原代基质细胞；S2：将永生化的脾原代基质细胞进行脱细胞处理得到脱细胞支架；S3：在脱细胞支架中添加间充质干细胞和淋巴组织诱导细胞进行混合培养后即形成人工淋巴结原基。本发明构建的人工淋巴结原基复刻了胚胎期淋巴结发生的生理过程，所得结构和功能更加完整，制备过程中不涉及异种蛋白，降低机体免疫和炎症风暴的风险。而且将人工淋巴结原基移植体内能较好地招募淋巴细胞，支持其增殖活化，并将活化的细胞再次输出至病灶局部发挥功能；可以达到恢复淋巴结缺陷的转基因小鼠乳腺癌荷瘤条件下的局部免疫清除功能的效果。

主权项：1.一种人工淋巴结原基的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：S1：制备永生化的脾原代基质细胞；S2：将永生化的脾原代基质细胞进行脱细胞处理得到脱细胞支架；S3：在脱细胞支架中添加间充质干细胞和淋巴组织诱导细胞进行混合培养后即形成人工淋巴结原基；所述淋巴组织诱导细胞的制备方法包括：在诱导多能干细胞中过表达转录因子，然后在分化培养基中培养，收集分化获得的淋巴组织诱导细胞；所述转录因子包括Rorγt、Id2和Runx1；步骤S3中所述间充质干细胞和淋巴组织诱导细胞的数量比为（5～10）：1；步骤S1中所述永生化的脾原代基质细胞的构建方法包括：将脾原代基质细胞进行慢病毒转染后通过嘌呤霉素筛选，对嘌呤产生耐药的细胞即为永生化的脾基质细胞；步骤S2的具体方法包括：（1）在培养皿中分别添加细胞贴壁促进剂、交联剂、氨基酸溶液进行处理，然后加入完全培养基对培养皿进行预处理；（2）消化永生化的脾原代基质细胞，然后种板至步骤（1）中所述的预处理后的培养皿；（3）当细胞单层融合后，更换成包含L-抗坏血酸的培养基，培养14～21天；（4）加入细胞裂解液清除多余细胞，然后加入DNaseI溶液去除残余的细胞DNA，即为脱细胞支架；所述细胞贴壁促进剂包括明胶；所述细胞贴壁促进剂的浓度为0.1～0.2%；所述交联剂包含醛类交联剂；所述醛类交联剂包含戊二醛、甲醛或葡萄糖醛；所述交联剂的浓度为0.5～1.5%；所述氨基酸包括甘氨酸；所述氨基酸浓度为0.5～1.5M。

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权利要求：

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