申请/专利权人：临沂大学

申请日：2021-05-10

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN113136444B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/01

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2021.08.06#实质审查的生效;2021.07.20#公开

摘要：本发明公开了一种海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'‑CCACTCAGCTTGATGTAA‑3'；反向序列：5'‑GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC‑3'；探针序列：5'‑6‑FAM‑ACAACAGCACCACGACGAT‑TAMRA‑3'；一种医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取25g样品至盛有225mL无菌水的均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释，得到待测样品；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液后进行检测与分析。结果表明该引物对海氏肠球菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为102‑107copiesµL的质粒标准品、102‑107CFUmL的菌液纯培养物及含有海氏肠球菌浓度为103‑107CFUg的模拟污染样品进行检测，灵敏度较好。

主权项：1.医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：1）海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37°C静置培养24h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37°C培养24h；称取25g样品至有225mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；2）分别取1mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：不含dUTP的2×ddPCRSupermixforProbes10µL、10µM的引物各0.4µL、10µM的探针0.4µL、DNA模版1µL，ddH2O补足至20µL；充分混匀后轻微离心，20µL混合液全量转移至Bio-RadDG8微滴生成卡中，去除其中气泡，添加70µL微滴生成油，固定微滴生成卡衬垫后，放置于QX100DropletGenerator仪器中生成油包水液滴；生成后微滴全量转移至96孔板中，封膜后使用普通PCR仪进行扩增反应；PCR反应程序为：95°C10min，1个循环；95°C30s，56°C30s，40个循环；98°C10min，1个循环；12°C降温保存产物；5）反应结束后使用QX100DropletReader对步骤4）中反应液读取微滴数及荧光信号，并进行数据处理；步骤3）中所述的鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'-ccactcagcttgatgtaa-3'；反向序列：5'-gtttgttcaataatcttcagatc-3'；探针：5'-6-FAM-acaacagcaccacgacgat-TAMRA-3'。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 临沂大学 医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法

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