申请/专利权人：北京惠之衡生物科技有限公司;惠升生物制药股份有限公司

申请日：2023-03-09

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN116425884B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C07K14/62;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2023.08.01#实质审查的生效;2023.07.28#著录事项变更;2023.07.14#公开

摘要：本发明涉及一种德谷胰岛素的纯化及制备方法。本发明充分利用Lys‑C酶特点，设计专门适用Lys‑C酶酶切的重组构建体，进而提高了酶切效率，降低了生产成本，使得本发明提供的纯化方法和制备方法具备较高的回收率和产品纯度。

主权项：1.一种德谷胰岛素肽链的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1收集包含德谷胰岛素前体融合蛋白的发酵液，所述德谷胰岛素前体融合蛋白的氨基酸结构如下所示：Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-Linker-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；其中，Leader为C末端为K的引导肽EEAEAEAEPK；Linker为C末端为K的连接肽MWK，分别与德谷胰岛素B链的C末端和德谷胰岛素A链的N末端相连；2发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、沉淀分离，得到所述德谷胰岛素肽链，所述酶切使用Lys-C酶，所述Lys-C酶为HSE-LC，其氨基酸序列如下所示：GVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGTLACTGSLVNNTANDRKMDFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRKDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLGQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP；其中，所述层析纯化处理的方法为：将发酵液离心收集上清液，上清液进行阳离子交换层析纯化处理，并收集洗脱溶液，使用的层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖；使用的平衡液为pH为3.0-4.0的无水乙酸钠；使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷；层析柱介质载量为50-55gL；所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节温度为33-36℃，调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:16000-16500的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应18-25h，得到酶切反应溶液；所述反相层析纯化处理的方法为：酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反向层析纯化处理，树脂载量为25-30gL，控制流速不高于420cmh，使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相，使用的平衡液为20％的B相，得到反相层析溶液；所述沉淀分离的方法为：将反相层析溶液稀释2-3倍，并调节pH至5.3-5.7，按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:9-12mL的比例添加纯化水洗涤，离心收集沉淀，重复洗涤1-2次，然后按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:9-12mL的比例添加纯化水，冻干；3将制备得到的德谷胰岛素肽链利用修饰剂进行修饰反应，反应结束后经过沉淀分离、脱保护，得到德谷胰岛素粗品，所述修饰剂为S-1-叔丁氧基-5-2,5-二羰基吡咯烷-1-基-2-16-叔丁氧基羰基十六烷酰胺基戊二酸酯；德谷胰岛素粗品经超滤、阴离子交换层析、反向层析I和等电点沉淀，得到德谷胰岛素纯品；所述修饰反应的方法包括：将德谷胰岛素肽链溶解在缓冲溶液中，调节pH至11-11.5，按照德谷胰岛素肽链:修饰剂的质量比为6.5-7.5:1的比例添加修饰剂，进行修饰反应25-35min；进行修饰反应后，所述沉淀分离和脱保护的方法为：将反应液进行稀释并调节pH至5.2-5.5，离心收集沉淀，干燥得干粉，然后按照干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:10-15mL的比例添加三氟乙酸，进行脱保护反应25-35min，得到德谷胰岛素粗品。

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