申请/专利权人：北京大学;陈志民

申请日：2016-08-30

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN107783267B

主分类号：G02B21/00

分类号：G02B21/00;G02B21/06;G02B21/10;G02B21/12

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2018.04.03#实质审查的生效;2018.03.09#公开

摘要：显微放大系统，包括透射光显微镜装置和荧光照明装置，显微镜装置包括照明光源（11）、第一聚光镜（12）、锥角反射器（13）、暗场照明器（14）、第二聚光镜（15）、样品池（16）、物镜（17）、辅助物镜（18）、分光镜（23）、阻挡滤光片（24）、管镜（25）、和图像采集器（26）。荧光照明装置包括荧光光源（31）、第三聚光镜（32）、第四聚光镜（33）、和取景标记器（34）。本发明的显微放大系统可以提供明场，暗场，荧光等多种照明方式，获得不同的显微观察效果，且能够在一个视野下同时清晰地观察多个样品，并仍然保持了常规显微镜系统只有在高倍放大条件下才具有的高数值孔径，因而保持了高分辨率。

主权项：1.显微放大系统，包括一个透射光显微镜装置（10）和一个荧光照明装置（30），其中：所述透射光显微镜装置（10）包括：一个照明光源（11），其光源波长在190nm至2000nm之间，一个第一聚光镜（12），其沿一个第一光轴（X）位于所述照明光源（11）的下游，一个锥角反射器（13），其沿所述第一光轴（X）位于所述第一聚光镜（12）的下游、且能够从所述第一光轴（X）中移开，该锥角反射器（13）的表面具有镜面反射的光学特性，一个暗场照明器（14），其环罩所述锥角反射器（13）且表面具有镜面反射的光学特性，该暗场照明器（14）将经所述锥角反射器（13）的光线斜向反射到一个第二聚光镜（15），并通过该第二聚光镜（15）汇聚到一个样品池（16）样品区域，其中：所述第二聚光镜（15），其沿所述第一光轴（X）位于所述暗场照明器（14）中心位置的暗场，若所述锥角反射器（13）移开所述第一光轴（X），透过所述第一聚光镜（12）的光线通过所述第二聚光镜（15），将光线汇聚到所述样品区域，能够实现一个明场照明，所述样品池（16），其沿所述第一光轴（X）位于所述第二聚光镜（15）的下游，且所述样品区域位于该样品池，一个物镜（17），其沿所述第一光轴（X）位于所述样品池（16）的下游，该物镜（17）的物方视野直径介于10mm至200mm之间、数值孔径大于0.3、分辨率不大于1μm，一个辅助物镜（18），其沿所述第一光轴（X）位于所述物镜（17）的下游，该辅助物镜（18）的孔径大于10mm，以保证与所述物镜（17）成像面积的匹配，一个分光镜（23），其沿所述第一光轴（X）位于所述辅助物镜（18）的下游，且沿所述第一光轴（X）的部分光线能够沿一个不同于所述第一光轴（X）方向的一个第二光轴（Y）通过该分光镜（23），一个阻挡滤光片（24），其沿所述第一光轴（X）位于所述分光镜（23）的下游，一个管镜（25），其沿所述第一光轴（X）位于所述阻挡滤光片（24）的下游，和一个图像采集器（26），其沿所述第一光轴（X）位于所述管镜（25）的下游；所述荧光照明装置（30）包括：一个荧光光源（31），其发射的荧光光束能够沿所述第二光轴（Y）照射至所述分光镜（23），并藉由该分光镜（23）反射至所述辅助物镜（18），进而照射所述样品区域，一个第三聚光镜（32），其沿所述第二光轴（Y）位于所述荧光光源（31）和所述分光镜（23）之间，一个第四聚光镜（33），其沿所述第二光轴（Y）位于所述第三聚光镜（32）和所述分光镜（23）之间，和一个取景标记器（34），其沿所述第二光轴（Y）位于所述分光镜（23）未设置所述荧光光源（31）的一侧。

全文数据：显微放大系统技术领域[0001]本发明涉及一种显微放大系统，特别是一种大视野、高通量的显微放大实验装置。背景技术[0002]目前，科研实验所使用的显微镜使用高倍镜增加放大倍数观察样品，虽然能看清样品的精细结构，但视野范围较小;若使用低倍镜观察样品，虽然视野范围扩大，但是分辨率却有所降低。[0003]目前，在实验过程中，不同种类或浓度的样品（如细胞需要分开培养、取样、制片。因现有显微镜无法同时观察不同样品的信息，常用的方法是，在一个样品观察结束后再观察另一个样品，或是在一个视野观察结束后再观察下一个视野。这样操作既繁琐，又无法在同一视野下观察所述样品，由些产生实验误差。[0004]另外，目前市售的荧光显微镜无法标明荧光是否发出、或是否照射在样品上，同样也可能产生实验误差。发明内容[0005]本发明旨在提供一种显微放大系统，它不仅能够在一个视野下同时清晰地观察多个样品，而且仍然保持了常规显微镜系统只有在尚倍放大条件下才具有的高数值孔径，因而保持了高分辨率。[0006]本发明的一种显微放大系统，包括一个透射光显微镜装置和一个荧光照明装置。透射光显微镜装置包括:一个照明光源，其光源波长在190nm至2000nm之间；一个第一聚光镜，其沿一个第一光轴位于照明光源的下游;一个锥角反射器，其沿第一光轴位于第一聚光镜的下游、且能够从第一光轴中移开，锥角反射器的表面具有镜面反射的光学特性;一个暗场照明器，其环罩锥角反射器且表面具有镜面反射的光学特性，该暗场照明器将经锥角反射器反射的光线再斜向反射到一个第二聚光镜，并通过第二聚光镜汇聚到一个样品池中的样品区域，其中第二聚光镜沿第一光轴位于暗场照明器中心位置的暗场，若锥角反射器移开第一光轴，透过第一聚光镜的光线通过第二聚光镜，将光线汇聚到所述样品区域，可实现一个明场照明，样品池沿第一光轴位于第二聚光镜的下游，且样品区域位于该样品池;一个物备，其沿第一光轴位于样品池的下游，物镜的物方视野直径在l〇mm至200mm之间、数值孔径大于0_3、分辨率不大于1M1;—个辅助物镜，其沿第一光轴位于物镜的下游，该辅助物镜的孔径大于10mm，以保证与物镜的成像面积相匹配;一个分光镜，其沿第一光轴位于辅助物镜的下游，且沿第一光轴的部分光线能够沿一个不同于第一光轴方向的一个第二光轴通过该分光镜;一个阻挡滤光片，其沿第一光轴位于分光镜的下游;一个管镜，其沿第一光轴位于阻挡滤光片的下游;和一个图像采集器，其沿第一光轴位于管镜的下游。荧光照明装置包括:一个荧光光源，其发射的荧光光束能够沿第二光轴照射至分光镜，并藉由该分光镜反射至辅助物镜，进而照射所述样品区域;一个第三聚光镜，其沿第二光轴位于荧光光源和分光镜之间；一个第四聚光镜，其沿第二光轴位于第三聚光镜与分光镜之间；和一个取景标记器，其沿第二光轴位于分光镜未设置焚光光源的一侧。[0007]本发明的显微放大系统，它能够提供视野数十倍于常规系统，可以一次观察很大范围的样品面积，不仅能够在一个视野下同时清晰地观察多个样品，而且仍然保持了常规显微镜系统只有在高倍放大条件下才具有的高数值孔径，因而保持了高分辨率分辨率与数值孔径值成反比关系），该高分辨率的显微放大系统用于配合超宽视野的显微成像;此外本发明在光源波长、显色性、照明口径、和光源取景标记器等方面都比常规系统的部件有改进。[00081在显微放大系统的另一种示意性实施方式中，其中位于图像采集器处的像方视场为特大靶面的数字图像传感器，有效信息量在107至101。像素之间。[00091在显微放大系统的另一种示意性实施方式中，照明光源发出的光经由第一聚光镜、锥角反射器、暗场照明器、和第二聚光镜，在样品区域形成直径在10111111至200111111之间的照明区。[0010]在显微放大系统的又一种不意性实施方式中，第二聚光镜的直径能够使其视野直径在10mm至200mm之间，且覆盖整个样品池。[0011]在显微放大系统的又一种不意性实施方式中，物镜的直径能够使物方视野直径在10mm至200mm之间，且能够全部接受经样品池通过的光。[0012]在显微放大系统的又一种示意性实施方式中，图像采集器为一种有效信息量将在107至101Q像素之间的图像采集器。[0013]在显微放大系统的又一种不意性实施方式中，第四聚光镜包括沿第二光轴设置的一组光学阻挡片和一组光栏，光栏间设于光学阻挡片之间。[0014]在显微放大系统的又一种不意性实施方式中，取景标记器包括沿第二光轴设置的一个投射光源、一个标尺模板、和一个投影镜头，投射光源为发光二极管，标尺模板位于投射光源与分光镜之间，投影镜头位于标尺模板与分光镜之间。[0015]在显微放大系统的又一种示意性实施方式中，第一聚光镜为单片非球面镜或多片球面镜构成。或者，第二聚光镜为单片非球面镜或多片球面镜构成。[0016]_另外，由于系统的检测信息量巨大，所以特别发明了具有特大采集面积和像素量的大幅面显微图像采集系统，其成像直径介于之间，像素量在将在107至1010像素之间，这些参数比常规系统高出数十倍，它可以获得大面积、高分辨率的形态、透射光、荧光、光谱、动态观测等多维图像大数据，实验结果更加准确可靠。[0017]在本发明的显微放大系统中，透射光显微镜装置和荧光照明装置中各部分装置在结构尺寸和光学元件的分辨率，视野范围等光学性能相匹配，其可实现物方视场10mm-200皿1、数值孔径大于〇_3,分辨率不大于iwn。该显微放大系统用于完成单独透射光的明场和暗场成像、单独的焚光成像、或透射光与焚光共同成像。附图说明[0018]以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围[0019]图1用于说明显微放大系统的示意性实施方式。[0020]标号说明1〇透射光显微镜装置11照明光源12第一聚光镜I3锥角反射器14暗场照明器15第二聚光镜16样品池17物镜18辅助物镜23分光镜24阻挡滤光片25管镜26图像采集器30荧光照明装置31荧光光源32第三聚光镜33第四聚光镜332光学阻挡片334光栏34取景标记器341投射光源342标尺模板343投影镜头X第一光轴Y第二光轴。具体实施方式[0021]为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式，在各图中相同的标号表示相同的$0。[0022]在本文中，“上游”、“下游”等仅用于表示相关部分之间的位置关系，而非限定它们的绝对位置。[0023]在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何图示、实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。[0024]在本文中，“第一”、“第二”等并非表示其重要程度等，仅用于表示彼此的区别，以利文件的描述。[0025]在本文中，“为”、“介于”等后面所示的数值并非严格的数学和或几何学意义上的限制，它也可以包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用该产品或方法时允许的误差。[0026]如图1所示，在显微放大系统一种示意性实施方式中，显微放大系统包括一个透射光显微镜装置10和一个荧光照明装置30，业慨現表直10包括一个照明光源i丨、一个第一聚光镜丨2、一个锥角反射器13、一个暗场照明器14、一个第二聚光镜15、一个样品池16、一个物镜17、一个辅助物镜18、一个分光镜23、、一个阻挡滤j片24、一个管镜25、和一个图像采集器26。荧光照明装置30包括一个荧光光源31、一个第三聚光镜32、一个第四聚光镜33、和一个取景标记器34。本显微放大系统可以提供明场，暗场，荧光等多种照明方式，获得不同的显微观察效果，其中：透射光显微照明装置可以做明场或暗场照明，照明光源丨丨的波长在在丨9〇11111至200〇11111之间，如可以采用亮度可调的发光二极管或者卤素灯等能够提供照明的光源，第一聚光镜12沿一个第一光轴X位于照明光源11的下游。锥角反射器13沿第一光轴x位于第一聚光镜12的下游，并且它能够从第一光轴X中移开，锥角反射器13的表面具有镜面反射的光学特性。暗场照明器14环罩锥角反射器13,并且它的表面具有镜面反射的光学特性。当选择暗场照明方式时，锥角反射器13置于第一光轴X中的第一聚光镜的下游，将来自第一聚光镜的照明光线偏折到暗场照明器14的环罩上，并由环罩再以较大的角度透过第二聚光镜倾斜并汇聚到样品池16的样品区域，这个倾斜的角度，能够保证照明光线不直接透过样品照到物镜17上，因而构成物镜17中只收到样品轮廓的图像信息，而背景是黑暗的暗场照明效果。当选择明场照明方式时，将锥角反射器13移开第一光轴X。透过第一聚光镜12的光线通过第二聚光镜15,将光线汇聚到样品池16的样品区域，物镜17收到透射照明背景光线和被照亮的样品图像信息，实现明场照明。[0027]样品池16沿第一光轴X位于第二聚光镜15的下游。物镜17沿第一光轴X位于样品池16的下游，物镜17的物方视野直径介于10mm至200mm之间、数值孔径大于0.3、分辨率不大于lMi。辅助物镜18沿第一光轴X位于物镜17的下游，且辅助物镜18的孔径大于10mm，起到矫正和确保物镜17的成像面积介于10mm至200mm的作用。[0028]分光镜23沿第一光轴X位于辅助物镜18的下游，且能按波长特征，将来自于第二光轴Y的荧光照明光线，转变方向，合并到第一光轴X中，并沿第一光轴X经由上游的辅助物镜18,物镜17,将荧光照明光线汇聚照射的样品池16的样品区域，实现荧光照明。同时，分光镜23还选择性地让来自上游的样品的部分光线穿透并沿第一光轴X方向，经下游的，沿第一光轴X位于分光镜23下游的阻挡滤光片24,沿第一光轴X位于阻挡滤光片24的下游的管镜25，透射并成像到沿第一光轴X位于目镜25的下游的图像采集器26上。[0029]荧光光源发射的荧光光束能够沿一个第二光轴Y照射至分光镜23,并藉由分光镜23反射至辅助物镜18,进而照射到样品区域。第三聚光镜32沿第二光轴Y位于荧光光源31和分光镜23之间。第四聚光镜33沿第二光轴Y位于第三聚光镜32和分光镜23之间。取景标记器34沿第二光轴Y位于分光镜23未设置荧光光源31的一侧。荧光光源可以为荧光发光二极管、汞灯或者氙灯等能够用于激发出荧光的光源。[0030]显微放大成像系统由第一光轴X中的物镜17,辅助物镜18,管镜25和图像采集器26组成。物镜17对第一光轴X上游的样品池16中被上述三种照明方式的一种照明方式照亮的样品进行聚焦成像，并把图像信息经过辅助物镜18对光束进行照^和像差的矫正，再经管镜25进行二次光学聚焦和放大，最终成像到图像采集器26的图像采集面上，图像采集器26将图像的光信息转换成数字图形信息，输出并存储，完成显微放大成像操作。[0031]在本发明的显微放大系统中，包括了透射光显微镜装置1〇和荧光照明装置30，它们的尺寸、分辨率都是互相匹配，以完成透射光和荧光共同成像。同时，既可以利用透射光显微镜装置10实现单独的透射光成像，也可以利用荧光照明装置30与样品池16、物镜17、辅助物镜1S、分光镜23、阻挡滤光片24、管镜25和图像采集器26实现单独的荧光成像。[0032]例如，在一种显微放大系统的实例中，物方视野直径为10mm，物镜17数值孔径〇•32，图像分辨率0.95wn，光学放大倍数l〇x，像面图像直径100mm，图像采集器26靶面尺寸为8〇mmx60mm圆内接矩形），像素为12310x9230=113620万像素，像素尺寸6.5x6.5um，相当于像面最小分辨率光斑直径的0_65x，系统的透射光照明器第一聚光镜12的直径为40mm，第二聚光镜15的直径为6〇mm，明场照明数值孔径〇_3，照明视野直径丨5mm，暗场照明数值孔径0.4-0.8，照明视野直径l5mm,;系统的辅助物镜18出口通光直径30mm，管镜25通光直径60mm，像面直径100mm，实际图像采集面80x60mm。[OO33]又例如，在一种细胞培养显微放大系统的实例中，样品培养在直径为2〇mm的培养池中，物方视野直径为20mm，物镜17数值孔径0.3,图像分辨率_，光学放大倍数5x，图像采集器26靶面尺寸为160xl2〇mm圆内接矩形），像素为35560x26670=94835万像素，实际像素尺寸4•5x4•5mi，相当于像面最小分辨率光斑直径的〇.9x，系统的透射光照明器第一聚光镜12的直径为5〇mm，第二聚光镜15的直径为70mm，明场照明数值孔径〇•3，照明视野直径25mm大于观察的视野范围，确保物方视野全被照亮），暗场照明数值孔径〇.4-〇.8，照明视野直径2^mm，；系统的辅助物镜18出口通光直径40ram，管镜25通光直径70mm，像面直径200mm，实际米像面积160_xl20mm。[0034]采用这种显微放大系统，有利于在一个视野下同时清晰地观察不同的样品，同时兼顾了大视场和高分辨率的要求，实验结果准确可靠。[0035]在显微镜放大系统一种示意性实施方式中，其中位于图像采集器26端面的像方视场有效信息量在1〇7至1〇1像素之间。[0036]在显微放大系统再一种示意性实施方式中，其中照明光源〖丨发出的光经由第一聚光镜12、锥角反射器13、暗场照明器14、和第二聚光镜丨5，能够在样品区域形成直径在丨0mra至200mm之间的照明区。[0037]在显微放大系统另一种示意性实施方式中，其中第二聚光镜15的直径能够使其视野直径在1〇mm至2〇〇mm之间，例如为1〇mm，且覆盖整个样品池16。[0038]在显微放大系统还一种示意性实施方式中，其中物镜17的直径能够使物方视野直径在10mm至200mm之间，且能够全部接受经样品池16通过的光。[00391在显微放大系统又一种示意性实施方式中，其中，图像控制器26为一种有效信息量在107至101°像素^司的图像采集器，如任何一种适用的CCI^CM0S数字相机。[0040]如图1所不，在显微放大系统中，其中所述第四聚光镜33可以包括沿第二光轴Y设置的一组光学阻挡片332和一组光栏334,这组光栏334间设于一组光学阻挡片332之间，用于控制荧光照明光束的大小和汇聚角度。[0041]另外，其中取景标记器34也还可以包括沿第二光轴Y设置一个投射光源341、一个标尺模板342、和一个投影镜头343。投射光源341为发光二极管，标尺模板342位于投射光源3M与分光镜23之间，而且标尺模板342由带有箭头或标尺线图案的光学镀膜刻度板或可变图案如日期、箭头、图案、标线、文字等的液晶板制成，投影镜头343位于标尺模板342与分光镜23之间。当投射光源341点亮时，投影标尺模板342被照亮，投影镜头343将标尺模板342的图案聚焦，并经过分光镜23转向，并入第一光轴X，经辅助物镜18，和物镜17在样品池16中的样品区域处成像，与该区域的样品位置叠加，并被物镜再次成像采集，获得带有标记信息的显微样品图像，这种图像标记与流行的在数字图像文件上叠加的标记不同，具有如下流行方式不能达到功能：1样品原位标记，无错位和误标记现象；2指示荧光工作状态3实时记录采集时的信息标尺模板342使用液晶图案屏时有效）虽然在图1所示的显微放大系统，其中所示的第一聚光镜I2和第二聚光镜15均显示为单片球面镜，但它们也可以分别由单片非球面或多片球面镜构成。[0042]采用这种显微放大系统，有利于在一个视野下同时清晰地观察不同的样品，同时兼顾了大视场和高分辨率的要求，无需根据不对的观察对象频繁地调整视场，且能保丨正实验结果准确可靠，可用于基因芯片测序、纳米微球基因分选等场合。’[0043]上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或^更均应包含在本发明的保护范围之内。x〆

权利要求：1.显微放大系统，包括一个透射光显微镜装置（10和一个荧光照明装置30，其中：所述透射光显微镜装置10包括：一个照明光源（11，其光源波长在190nm至2000nm之间，一个第一聚光镜12，其沿一个第一光轴X位于所述照明光源（11的下游，一个锥角反射器（13，其沿所述第一光轴X位于所述第一聚光镜（12的下游、且能够从所述第一光轴X中移开，该锥角反射器I3的表面具有镜面反射的光学特性，一个暗场照明器（14，其环罩所述锥角反射器（13且表面具有镜面反射的光学特性，该暗场照明器14将经所述锥角反射器I3的光线斜向反射到一个第二聚光镜15，并通过该第二聚光镜15汇聚到一个样品池16样品区域，其中：所述第二聚光镜（15，其沿所述第一光轴X位于所述暗场照明器（14中心位置的暗场，若所述锥角反射器I3移开所述第一光轴X，透过所述第一聚光镜（12的光线通过所述第二聚光镜15，将光线汇聚到所述样品区域，能够实现一个明场照明，所述样品池（16，其沿所述第一光轴X位于所述第二聚光镜（15的下游，且所述样品区域位于该样品池，一个物镜（I7，其沿所述第一光轴X位于所述样品池（16的下游，该物镜（17的物方视野直径介于10mm至200mm之间、数值孔径大于0.3、分辨率不大于lwn，一个辅助物镜（18，其沿所述第一光轴X位于所述物镜（17的下游，该辅助物镜（18的孔径大于10mm，以保证与所述物镜17成像面积的匹配，一个分光镜23，其沿所述第一光轴X位于所述辅助物镜（18的下游，且沿所述第一光轴X的部分光线能够沿一个不同于所述第一光轴X方向的一个第二光轴Y通过该分光镜23，一个阻挡滤光片24，其沿所述第一光轴X位于所述分光镜23的下游，一个管镜25，其沿所述第一光轴X位于所述阻挡滤光片24的下游，和一个图像采集器26，其沿所述第一光轴X位于所述管镜25的下游；所述荧光照明装置30包括：一个荧光光源（31，其发射的荧光光束能够沿所述第二光轴Y照射至所述分光镜23，并藉由该分光镜23反射至所述辅助物镜18，进而照射所述样品区域，一个第三聚光镜（32，其沿所述第二光轴（Y位于所述荧光光源（31和所述分光镜23之间，一个第四聚光镜33，其沿所述第二光轴Y位于所述第三聚光镜32和所述分光镜23之间，和一个取景标记器34，其沿所述第二光轴Y位于所述分光镜23未设置所述荧光光源31的一侧。2.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中位于图像采集器26处的像方视场为特大靶面的数字图像传感器，有效信息量在1〇7至1〇10像素之间。3.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中所述照明光源（11发出的光经由所述第一聚光镜（12、所述锥角反射器（13、所述暗场照明器（14、和所述第二聚光镜（15，在所述样品区域形成直径在1〇mm至200mm之间的照明区。4.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中所述第二聚光镜（15的直径能够使其视野直径在10mm至200mm之间，且覆盖整个所述样品池（16。5.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中所述物镜（17的直径能够使物方视野直径在10mm至200mm之间，数值孔径大于〇•3、分辨率不大于1wn，且能够全部接收经所述样品池16通过的光。6.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中所述第四聚光镜33包括沿所述第二光轴Y设置的：一组光学阻挡片332，和一组间设于所述光学阻挡片幻2之间的光栏334。7.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中所述取景标记器34包括沿所述第二光轴Y设置的：一个投射光源341，其为发光二极管，一个标尺模板342，其位于所述投射光源341与所述分光镜23之间，和一个投影镜头343、其位于所述标尺模板342与所述分光镜23之间。8.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中，所述第一聚光镜（12为单片非球面镜或多片球面镜构成。9.根据权利要求1所述的显微放大系统，其中，所述第二聚光镜（15为单片非球面镜或多片球面镜构成。

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