申请/专利权人：深圳大学

申请日：2015-07-27

公开（公告）日：2017-11-07

公开（公告）号：CN105203770B

主分类号：G01N33/68(2006.01)I

分类号：G01N33/68(2006.01)I;G01N33/577(2006.01)I;G01N33/543(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2017.11.07#授权;2016.01.27#实质审查的生效;2015.12.30#公开

摘要：本发明涉及STIM1蛋白在诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的药物的制备中的用途。

主权项：STIM1蛋白在诊断缺血性脑卒中风的药物的制备中的用途，其中所述诊断包括疾病严重程度的诊断和或疾病预后恢复的诊断，所述诊断通过测定外周血中血小板内STIM1蛋白的含量进行。

全文数据：STIM1蛋白在相关疾病风险诊断中的应用技术领域[0001]本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及STMl蛋白在诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的药物的制备中的用途以及用于所述用途的酶联免疫试剂盒。背景技术[0002]血小板，是一类无核细胞，是由骨髓中的巨核通过一个复杂的过程释放出。血小板的激活和聚集是血管损伤后保护机体的重要生理过程，这个过程是一个多步骤的级联反应过程。但是这项生理过程也成为很多血管疾病例如血栓形成主要原因。血小板粘附、激活以及聚集到内皮细胞暴露的外基质可引起止血反应，同时会导致血栓形成。血小板活化的始动因素是细胞内游离f丐离子浓度上升，而由基质相互作用分子IstromalinteractionmoleculesI，STIM1和细胞膜蛋白Orai1所构成的库操控的I丐通道（store-operatedcalciumchannels，S0CC便是血小板激活的主要通路之一[ProgressinPhysiologicalSciences，2012，43:417-421]ΑΊΊΜΙ高表达于血小板，研究发现，敲除STIMl后的小鼠与野生型小鼠相比，表现出更高的出生后致死率和明显的发育迟缓[JExpMed，2008,205，1583-1591]。在高剪切力下，与正常组小鼠相比敲除SIlMl组小鼠的血小板表现出黏附能力减弱、血栓覆盖率减弱、血栓体积减小[JExpMed，2008，205，1583-1591]。SHMl和Orai1共同参与GPVI诱导的库操控的I丐流入store-operatedCa2+entryS0CE、凝血酶源激活和血栓形成[JBiolChem,2010,285,23629-23638]。敲除STIMl的血小板可以显著抑制血小板胶原受体糖蛋白VI依赖性钙信号，导致磷脂酰丝氨酸血小板凝血活性所必需成分的暴露减少，从而抑制血栓形成[JExpMed，2008，205，1583-1591]。由此可见，SIlMl在血栓形成的过程中起着至关重要的作用。[0003]缺血性脑卒中（cerebralischemicstoke是指脑部血流循环障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。缺血性脑卒中主要包括脑血栓形成和脑栓塞两种，而血管壁病变、血管压迫、心脏疾病、血流动力学改变以及血液成分的改变等均可引发缺血性脑卒中。缺血性脑卒中的临床表现比较复杂，取决于梗死部位和梗死体积，主要以局灶性神经功能缺损的症状和体征为特征，如偏瘫、偏身感觉障碍、失语、共济失调等，还有部分可表现为头痛、呕吐、昏迷等全脑症状。依据2010年全球疾病负担研究GBD2010结果显示NEnglJMed,2013,369:448-457，脑卒中已经成为一个全球性的健康问题，是影响寿命、导致伤残第3位的原因。根据相关部门最新统计显示，我国每年新发脑卒中患者250万人，并以每年8.7%的速度上升，目前脑卒中患者至少700万人，致残率高达75%，已成为中国第一的死亡原因。脑卒中主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类，在一些发达国家中，高达67.3%〜80.5%的脑卒中病例归因于缺血性脑卒中，而根据我国卫生部统计，缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的45.5%-75.9%。目前，由于社会压力和生活习惯的影响，青年人群的发病率逐年增加。每年由脑卒中造成的直接和间接经济损失高达数百亿元。因此，脑卒中不仅是医学难题，更是不容忽视的社会问题。[0004]因此，本领域中存在对在人群中诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的需要，即存在对患有所述疾病的风险的诊断、所述疾病严重程度的诊断和或所述疾病预后恢复的诊断的需要。这对相关疾病的预测、预防具有重要的临床意义和社会经济效益。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的简单快捷的方法以及相关药物。[0006]在第一方面，本发明提供了STIMl蛋白在诊断与血小板在内皮细胞暴露的外基质上粘附、激活或聚集相关的疾病风险的药物的制备中的用途。[0007]在本发明的实施方案中，所述疾病可以是血栓，优选地为脑血栓，更优选地为脑血栓引起的缺血性脑卒中风。[0008]在本发明的实施方案中，所述诊断可以包括患有所述疾病的风险的诊断、所述疾病严重程度的诊断和或所述疾病预后恢复的诊断。[0009]在本发明的实施方案中，所述诊断可以通过测定外周血中血小板内STMl蛋白的含量进行，优选地通过酶联免疫检测进行。[0010]在本发明的实施方案中，所述药物可以包含所述SHMI蛋白的抗体，优选地包含捕获抗体A和或酶标检测抗体B。[0011]在本发明的实施方案中，所述药物可以包括试剂盒，优选地，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。[0012]在第二方面，本发明提供了用于如第一方面所述的用途的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包含所述STIMl蛋白的捕获抗体A和所述STIMl蛋白的酶标检测抗体B。[0013]在本发明的实施方案中所述捕获抗体A和所述酶标检测抗体B可以通过以下方法制备：[0014]1单克隆细胞制备:将表达纯化的所述STIMl蛋白与等体积的弗氏佐剂、Y0UL0NG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，免疫4只Balbc小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测；最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后，将小鼠处死，得到脾细胞，加入SP20骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合;将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后用HT培养液培养，10天后，取细胞培养上清进行检测得到阳性孔;使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，从而建立不少于50株阳性细胞株；[0015]2单克隆抗体制备与纯化:在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将所获得的阳性细胞株细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水;于4000rpm室温离心腹水15min，取上清，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，于13000印1]1，41:50000。[0045]2.3.3取血：[0046]耳缘静脉加强免疫，加强免疫半个月后采集兔血全部采集）。[0047]2.3.4多克隆抗体纯化：[0048]兔血离心15min4000rpm，室温），取上层血清，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min13000rpm，4°C，弃上清；沉淀溶于适量PBS0.01M，pH7.4;在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min13000印111，4°〇，弃上清;沉淀溶于适量?830.0謂，？!17.4，4°：透析过夜，测定抗体含量，-20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用ProteinA小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml0.4MI3B缓冲液pH7.0平衡纯化小柱;抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml0.4MPB缓冲液pH7.0平衡纯化小柱；5ml0.IM甘氨酸-盐酸缓冲液pH3.0洗脱结合位点上的抗体，并加入IMTris-HClpH8.0中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。[0049]2.4单抗制备[0050]2.4.1免疫原制备：[0051]将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂、Y0UL0NG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫小鼠。[0052]2.4.2免疫策略：[0053]将蛋白免疫4只Balbc小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测。[0054]2.4.3细胞融合：[0055]最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70%乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP20骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，[0056]2.4.4融合筛选：[0057]将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。[0058]2.4.5克隆化与建株：[0059]使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株，不少于50株细胞株。[0060]2.4.6扩大培养:将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。[0061]2.5抗体制备与纯化[0062]2.5.1腹水制备：[0063]提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。[0064]2·5·2单克隆抗体纯化：[0065]腹水离心15min4000rpm，室温），取上清，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min13000rpm，4°C，弃上清;沉淀溶于适量PBS0.OlM，pH7.4;在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min13000印111，4°〇，弃上清;沉淀溶于适量?830.0謂，？!17.4，4°：透析过夜，测定抗体含量，-20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用ProteinG小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml0.4MI3B缓冲液pH7.0平衡纯化小柱;抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上;继续IOml0.4MPB缓冲液pH7.0平衡纯化小柱;5ml0.IM甘氨酸-盐酸缓冲液pH2.7洗脱结合位点上的抗体，并加入IMTris-HClpH8.0中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。[0066]2.5.3效价测定：[0067]用包被缓冲液稀释HPT蛋白，包被浓度为lugml，每孔包被IOOul，4°C过夜包被，洗板，150ul封闭缓冲液封闭，37°C3h。将纯化好的抗体用抗体稀释液进行梯度稀释，每孔100μ1，37°C反应Ih;洗板，每孔加入100μ1酶标二抗，37°C反应Ih;洗板，[0068]每孔加入100μ1显色剂，室温避光反应15min，450nm读取OD值。以0.5作为截断值，得到抗体的效价。[0069]2.6配对筛选[0070]2.6.1包被：[0071]将纯化后的鼠单抗用PH9.6的碳酸盐缓冲液包被液，下同）按照1:100倍稀释，100μ!7孔加至多孔板，4°C包被过夜。[0072]2.6.2封闭：[0073]洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin，10%羊血清封闭（用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:9倍稀释），每孔150yL，恒温37°C封闭3小时。[0074]2.6.3加样：[0075]加入浓度梯度为1000、100、10、0??13的51'頂1蛋白溶液高标），加入阴性对照，10^L孔，25°C，温育45min。[0076]2.6.4加检测抗体：[0077]将得到的单克隆抗体逐一常规标记辣根过氧化物酶作为检测抗体，洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin，用稀释液按1:1000视效价而定）比例稀释检测抗体，充分混匀，每孔1〇〇μ1，25°C，温育45min。[0078]2·6·5显色：[0079]洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300yL，时间为Imin，每孔加TMBIOOyL，25°C反应15min〇[0080]2·6·6检测：[0081]加入2MH2S〇4，100yL孔，450nm读取OD吸光度）值。[0082]2.6.7结果：[0083]单抗中，强阳性单抗与兔多抗进行配对或者强阳性单抗之间进行配对。根据最强结合信号，确定出最佳的包被抗体A和检测抗体B酶标抗体B[0084]配对效果检测[0085][0086]2.6.8灵敏度确定：[0087]选取配对筛选阴性值低，阳性值高的一对包被抗体A和检测抗体B，按照前述方法，加入不同浓度的标品与酶标抗体B，确定灵敏度与酶标抗体B使用浓度。[0088][0089]实施例2:建立并优化ELISA测试方法：[0090]包括试剂的组成成分的确定，捕获和检测抗体用量的确定，以及对特异性和灵敏度的测试，组间和组内误差的测试，样品回收率的确定。该检测方法的检测灵敏度为5ngml，标准曲线为50ngml到1000ngml;对于样品浓度为110-920ngml的STIMl，回收率〉90%。对于低浓度200ngml，中浓度500ngml和高浓度800ngml，其组内变异系数分别为3.6%，5.1%和5.9%，而组间的变异系数分别为6.1%，7.9%和9.2%。试剂盒真阳性率为：84.8%;特异度真阴性_:85.1%;假阳性率:5%;假阴性率16%。[0091]实施例3:根据本发明的诊断试剂盒及其示例性诊断应用[0092]1·1试剂[0093]1·1·1包被缓冲液，0·IM碳酸盐缓冲液CB，pH值为9·6;[0094]1·1·2稀释液，0·OlmM磷酸盐缓冲液PBS，pH值为7·4;[0095]1.1.3洗涤液，含0.2%吐温-20的PBS;[0096]1.1.4封闭液含1%BSA的CB;[0097]1·1·5终止液2MH2SO4[0098]1.1.6蛋白标准品制备:大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的STIMl，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉，根据具体的灵敏度稀释成不同的浓度。l〇〇〇ngml，500ngml，250ngml，50ngml，0ngml〇[0099]1.1.7捕获抗体A和酶标检测抗体B:[0100]1.1.7.1酶标抗体的制备:取纯化的抗体，与HRP进行偶联，得到酶标记抗体B。[0101]1.1.7.2取一定量的酶标记抗体B加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2ygmL，（根据具体的条件而定2-8°C避光保存。[0102]1.2酶标板的制备[0103]1.2.1包被[0104]移取一定量STIMl抗体于所需体积的包被液中，使其达到一定的浓度成包被工作液。将包被工作液按每孔IOOyL加入酶标板微孔，4°C静置过夜注意要防止水分蒸发）。[0105]1.2.2封闭[0106]在CB缓冲液pH9.6中加入一定量的小牛血清，水杨酸钠，蔗糖，使小牛血清，水杨酸钠，蔗糖的浓度分别为10%，〇.05%，5%，配置成封闭工作液。酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。将封闭工作液按每孔150yL加入微孔，37°C烘焙3小时。[0107]1.2.3抽干密封[0108]弃去封闭液，将板条在洁净的吸水纸上拍干，放入冷冻真空干燥机抽干3小时，真空热封。[0109]1.2.4试剂盒的组装[0110][0111][0112]1.3使用本发明试剂盒检测人体中的蛋白STIMl[0113]加标准品或未知浓度样品：[0114]1.3.1将IOOyL的样品稀释液空白对照标准品未知浓度样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25°C避光环境中反应45min。[0115]1.3.2未知样本处理:EDTA管收集人外周血5-10ml，1000rpm，10分钟，取上清。将上清再次离心，2000rpm，20分钟，弃上清，留取沉淀。加30ulRIPA加1:1000PMSF，冰上静置20分钟，上下吹打。离心，留取上清。[0116]1.3.3检测1.3.2中上清未知样本血小板蛋白浓度。-20°C储存。[0117]1.3.2洗板:将孔内液体甩干，用250yL洗涤液孔充分洗涤3次，每次间隔Imin，用吸水纸拍干。[0118]1.3.3加酶标抗体:加入酶标抗体lOOyL孔，轻轻振荡混匀，25°C避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤2[0119]1.3.4显色:加入显色剂IOOyL孔，置于25°C避光环境中反应15min。[0120]1.3.5测定:加入IOOyL终止液孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值优选用双波长450630nm进行检测，在5min内读完数据）。若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定。[0121]1.3.6计算:利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线，如图1所示;通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中STMl的浓度需除以各样本蛋白浓度）。[0122]表1:正常未患病人群和缺血性脑卒中患病人群的外周血清中SHMl结果对比。[0123][0124]从表1可见，在患病人群中，即使STIMl蛋白表达量较低的低表达组，其平均STIMl蛋白表达量也为正常人群表达量的2.83倍，因此我们可以通过将STIMl蛋白的表达量定量来诊断受试者是否患有缺血性脑卒中，或者是否具有更高的发生脑卒中的风险。[0125]表2:将STIMl表达低组和中组合并与高表达组进行三个月的出院后NIHSS评分的对比，SHMl高表达组的NIHSS评分明显差于低表达和中表达组p〈0.005。[0126][0127]从表2中可知，患病严重程度不同的病人的外周血血小板内STIMl蛋白表达量存在差异，或者说外周血血小板内SHMl蛋白表达量与病人的患病严重程度存在正相关的关系，因此我们可以通过将STIMl蛋白的表达量定量来诊断受试者的患病严重程度、预后恢复等等。[0128]以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.STMl蛋白在诊断缺血性脑卒中风的药物的制备中的用途，其中所述诊断包括疾病严重程度的诊断和或疾病预后恢复的诊断，所述诊断通过测定外周血中血小板内SHMl蛋白的含量进行。2.如权利要求1所述的用途，其中所述诊断通过酶联免疫定量检测试剂盒进行检测。3.如权利要求1所述的用途，其中所述药物中包含所述SHMl蛋白的抗体。4.如权利要求3所述的用途，其中所述药物中包含捕获抗体A和或酶标检测抗体B。5.如权利要求4所述的用途，其中所述药物包括试剂盒。6.如权利要求5所述的用途，其中所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。7.—种酶联免疫试剂盒在诊断缺血性脑卒中风的药物的制备中的用途，其中所述诊断包括疾病严重程度的诊断和或疾病预后恢复的诊断，所述诊断通过测定外周血中血小板内STIMl蛋白的含量进行，所述试剂盒包含所述STIMl蛋白的捕获抗体A和所述STIMl蛋白的酶标检测抗体B，所述试剂盒还包括:包被缓冲液，0.IM碳酸盐缓冲液CB，pH值为9.6;稀释液，0.0ImM磷酸盐缓冲液PBS，pH值为7.4;洗涤液，含0.2%吐温-20的PBS;封闭液含1%BSA的CB;和终止液，2M的H2S〇4。8.如权利要求7所述的用途，其中所述捕获抗体A和所述酶标检测抗体B通过以下方法制备：1单克隆细胞制备:将表达纯化的所述SHMl蛋白与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，免疫4只Balbc小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测；最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后，将小鼠处死，得到脾细胞，加入SP20骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合;将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后用HT培养液培养，10天后，取细胞培养上清进行检测得到阳性孔;使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，从而建立不少于50株阳性细胞株；2单克隆抗体制备与纯化:在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将所获得的阳性细胞株细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水;于4000rpm室温离心腹水15min，取上清，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，于13000rpm，4°C离心30min，弃上清;将沉淀溶于〇.〇IM，pH7.4的I3BS;在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，于13000rpm，4°C离心30min，弃上清；沉淀溶于0.01M,ρΗ7·4的PBS，4°C透析过夜；3配对筛选:将纯化后的单克隆抗体作为包被抗体，用pH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:100倍稀释，IOOyL孔加至多孔板，4°C包被过夜;含0.2%吐温-20的PBS作为洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为Imin，用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:9倍稀释10%羊血清进行封闭，每孔150此，恒温37°C封闭3小时；加入浓度梯度为1000、100、UKOppb的SHMl蛋白溶液，加入阴性对照，IOO1IL孔，25°C，温育45min;洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为Imin;将得到的单克隆抗体逐一常规标记辣根过氧化物酶作为检测抗体，用稀释液按1:1000比例稀释，充分混匀，每孔100μΐ，25°C，温育45min;洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300yL，时间为Imin，每孔加TMB100此，25°：反应15min;加入2M的!125〇4,IOO1IL孔，450nm读取吸光度值，选择结合信号最强的一对包被抗体和检测抗体分别作为用于所述试剂盒的所述捕获抗体A和所述酶标检测抗体B。

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