申请/专利权人：广州华津医药科技有限公司

申请日：2017-04-01

公开（公告）日：2017-07-04

公开（公告）号：CN106913883A

主分类号：A61K48/00(2006.01)I

分类号：A61K48/00(2006.01)I;A61K38/51(2006.01)I;A61K35/74(2015.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P35/04(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.08.01#发明专利申请公布后的驳回;2017.07.28#实质审查的生效;2017.07.04#公开

摘要：本发明属于基因工程药物技术领域，具体涉及一种基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗肺癌药物中的新应用。本发明公开了所述基因工程菌VNP20009‑M在现有基础上用于治疗肺癌，所述基因工程菌VNP20009‑M能够有效杀伤肿瘤细胞，消除肿瘤病灶，且所述基因工程菌对人体无明显毒副作用，为肺癌的治疗提供了安全有效的新途径。

主权项：基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗肺癌药物中的应用。

全文数据：基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肺癌药物中的应用技术领域[0001]本发明属于基因工程药物技术领域，具体涉及一种基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肺癌药物中的新应用。背景技术[0002]癌症已经成为人类死亡的重要原因，2005年至2015年间癌症发病率增加了33%。世界卫生组织WHO发表的《全球癌症报告2014》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。[0003]其中，肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居于首位，仅在2012年全球几乎有160万人死于肺癌。中国肿瘤登记中心2015年报显示，肺癌的发病率和死亡率在中国也均居于首位，中国新增肺癌病例七十多万，死亡人数有六十多万。大部分肺癌患者发现较晚，只适用药物治疗，肺癌的传统治疗方法包括局部治疗包括手术治疗、放射治疗等和全身性治疗包括传统化疗、分子靶向药物治疗等）。尽管现代医学研究取得了巨大进步，发明了吉非替尼、厄洛替尼等众多靶向药物，使得肺癌在放疗、化疗、手术治疗方面取得了一定进展，但整体预后还是较差。2015年统计数据显示，我国肺癌患者5年生存率仅为16.1%。因此寻找治疗肺癌的新方法，也成为了科学家们亟待解决的问题。[0004]现有技术表明，甲硫氨酸依赖是绝大部分肿瘤细胞的特性，表现为肿瘤细胞对甲硫氨酸的过分需求，在去除甲硫氨酸或以其前体一同型半胱氨酸替代的培养基培养时，细胞增殖受到抑制；而在甲硫氨酸存在的环境下则能正常生长，其中包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等十多种恶性肿瘤细胞。但是，正常细胞不存在甲硫氨酸依赖性。造成甲硫氨酸缺乏的方法主要包括去除膳食中的甲硫氨酸，或者利用甲硫氨酸酶分解甲硫氨酸。然而单独限制饮食中甲硫氨酸的摄入来降低甲硫氨酸水平效果有限，而长期限制甲硫氨酸的摄入会引起机体营养不良、代谢障碍。相比于饮食限制甲硫氨酸摄入，利用甲硫氨酸酶methioninase不会引发过度的代谢问题，并具抗肿瘤效应。[0005]沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。其中，已知菌株VNP20009是一种高肿瘤靶向性、安全性以及具有抗肿瘤效应的载体。它对恶性黑色素瘤、肺癌等多种小鼠实体瘤模型有显著的抑制肿瘤生长效果。美国进行的两项I期临床研究表明其可以用于人体，具有安全性，但是没有观察到抗肿瘤效果。发明内容[0006]为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肺癌药物中的新应用。[0007]为解决上述技术问题，本发明公开了所述的基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肺癌药物中的应用。[0008]进一步的，所述肺癌包括肺部原生肿瘤、肺癌术后复发肿瘤以及肺癌转移肿瘤。[0009]进一步的，所述肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌等。[0010]所述非小细胞肺癌起源于上皮细胞，是肺癌的主要类型，包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞肺癌或未分化癌。[0011]鳞癌是各种类型肺癌中最为常见，约占50%，患病年龄大多在50岁以上，男性占多数大。多起源于较大的支气管常为中央型肺癌，对放化疗治疗敏感度不及未分化癌。[0012]腺癌，起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺，女性相对多见。早期一般没有明显的临床症状，发现时可发生局部侵润或血行转移，临床易转移至肝、脑和骨等器官，还可累及胸膜引起胸腔积液。腺癌对放射治疗敏感度差。[0013]腺鳞癌和大细胞癌，恶性程度较高，分化程度低，容易发生脑转移，治疗效果差，预后不良。目前治疗肺大细胞癌临床多以综合治疗为主，单纯手术或放化疗效果差。[0014]未分化癌，发病率仅次于鳞癌多见于男性，发病年龄较轻，未分化癌恶性度高生长快，而且较早地出现淋巴和血行广泛转移，对放射和化学疗法较敏感，在各型肺癌中预后最差。[0015]小细胞癌又称小细胞神经内分泌癌，是肺癌中恶性程度最高的一型。此型肺癌生长速度快，转移早，常转移至脑、肝、骨、肾上腺等脏器，存活期大多不超过1年。手术切除效果差，但对放化疗敏感，但放化疗常常伴有强烈的毒副作用和并发症，预后较差。[0016]优选的，所述基因工程菌VNP20009-M的最低有效施用剂量为3.5*107CFUM2。[0017]所述基因工程菌VNP20009-M用于癌症预防和治疗的给药方式可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口服给药、局部给药、注射给药包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、瘤内给药等。[0018]本发明还公开了基因工程菌VNP20009-M在制备甲硫氨酸酶剂中的应用。所述基因工程菌VNP20009-M具有较高的甲硫氨酸酶活性，可作为甲硫氨酸酶剂的制备之用。[0019]上述甲硫氨酸酶剂的给药方式可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口服给药、局部给药、注射给药包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、瘤内给药等。[0020]如现有技术中已知的，本发明上述基因工程菌VNP20009-M为已知菌株，其性能、形状、构建方法均如中国专利CN105983103A中所记载。[0021]所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有Lnethioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。[0022]进一步的，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。[0023]所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。[0024]所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到:将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。[0025]最为优选的是，在构建基因工程菌VNP20009-M的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，然后将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中得到基因工程菌。[0026]其中，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25yF，放电时间4ms。[0027]本发明公开了所述基因工程菌VNP20009-M在现有基础上用于治疗肺癌的新应用，所述基因工程菌VNP20009-M能够有效杀伤肺癌肿瘤细胞，消除肺癌肿瘤病灶，对于原发性肺癌、肺癌术后复发、以及肺癌转移至其他部位的肿瘤细胞，都具有较好的杀伤效果，治疗效果较佳;而且所述基因工程菌对人体无明显毒副作用，为肺癌的治疗提供了安全有效的新途径。附图说明[0028]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，[0029]图1为质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1%琼脂糖凝胶电泳图；[0030]图2为本发明是Westernblot鉴定methioninase表达结果图；[0031]图3为本发明检测沙门氏菌中methioninase活性结果图；[0032]图4为实施例2中患者脖颈处新生病灶状况；[0033]图5为实施例2中患者肿块部位活检细胞涂片；[0034]图6为实施例2中患者治疗3周后肿块状况；[0035]图7为实施例2中患者治疗5周后肿块状况；[0036]图8为实施例2中患者治疗12周后原病灶部位的状况；[0037]图9为实施例2中患者治疗1周后肿块内部的细胞学涂片；[0038]图10为实施例2中患者治疗3周后肿块内部的细胞学涂片。具体实施方式[0039]实施例1基因工程菌VNP20009-M的构建[0040]本发明所述基因工程菌VNP20009-M的构建方法和过程如中国专利CN105983103A中实施例中所记载。[0041]1构建表达L-methioninase基因的质粒。[0042]先合成L-methioninaseGenBank:L43133·1基因亚克隆至pUC57质粒（金斯瑞公司），接着通过KpnI和HindIII酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒（invitrogen，得到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下：[0043]将pSVSPORT质粒用KpnI和HindIII双酶切，酶切体系为：2yg质粒DNA，3yL10Xbuffer，1.5yLKpnI酶，1.5yLHindIII酶，加入ddH20补足体积至30yL，37°C温浴3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.Ikb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。[0044]通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒金斯瑞公司），用KpnI和HindIII双酶切，酶切体系为：3yg质粒DNA，3yL10Xbuffer，1.5yLKpnI酶，1.5yLHindIII酶，加入ddH20补足体积至30yL，37°C温浴3h。然后将酶切体系在I%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。[0045]将pSVSPORTKpnIHindIII和L-methioninase编码区域DNA片段（Kpn1HindIII连接，连接反应中加入2yL载体、6yL插入片段、IyLT4DNA连接酶，16°C温浴16h。[0046]将连接产物转化到E.coliDH5aTakara的感受态细胞中。取一管50yL的DH5a感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5yL上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min;42°C热击60s，后冰上静置2min;加入500yL无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养Ih后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，过夜培养。[0047]克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养16h，提取质粒DNA，用KpnI和HindΙΠ酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。[0048]2构建携带质粒的VNP20009菌和携带克隆有Lnethioninase的基因的质粒的VNP20009菌。[0049]将pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表达质粒分别电转化至VNP20009菌株YS1646，ATCC号202165，分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过程如下：[0050]将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2yL质粒，轻弹混匀，于冰上孵育lmin。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电阻400Ω，电容25yF，放电时间4ms。电击完立刻加入ImLSOC培养基，轻轻混匀。37°C震荡培养Ih;用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16ΚνΝΡ20009-ν和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴定正确。[0051]取1X108沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭Ih后，TBST漂洗3X5min，加入兔抗Liethioninase抗体（1:1000，4°C孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗（1:10000，室温孵育Ih，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009、VNP20009-V相比，Liethioninase表达量显著提尚。[0052]将L-甲硫氨酸和吡哆醛分别与VNP20009-V和VNP20009-M菌体混合，37°C孵育IOmin后用50%三氯乙酸终止，离心取上清，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物MBTH充分混匀，50°C孵育30min后，测定320nm处的吸光值，以每分钟催化转化Ιμπιοΐα-酮丁酸的酶量定义为1个酶活性单位。结果显示（如图3所示），沙门菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009-V高10倍。[0053]可见，所构建基因工程菌沙门菌VNP20009-M具有较高的甲硫氨酸酶活性，可作为甲硫氨酸酶剂的制备之用。[0054]实施例2基因工程菌VNP20009-M的抗肿瘤效果[0055]1、过往病史及诊断[0056]临床一男性患者，73岁，行胸腔镜下右肺下叶鳞癌根治术后5个月，发现脖颈处新生肿块如图4所示），测量脖颈处病灶肿块大小约为8cmX9cm。肿块部位活检经细胞涂片鉴定为癌细胞如图5所示），且骨骼ECT显示多处骨代谢活跃，胸部CT检查报告胸骨破坏伴肿块形成。[0057]根据患者既往治疗及相关检查，诊断患者右肺下叶鳞癌术后复发转移，但是临床上已经没有标准治疗方案。[0058]2治疗方案[0059]将稀释后的¥即20009-1均匀多点注入肿瘤部位，第一次给予6*10丨作（约为3.5*107cfum2。间隔一周后，继续进行第二次给药，药物总量提高至9*107cfu约为5*107cfum2。同样采取瘤内注射，均匀多点注射药物。间隔一周，进行第三次给药，与第二次相同的方法和剂量。间隔10天，进行第四次给药，药物浓度提高到6*107cfum2,瘤内给药。间隔10天，继续进行第五次给药，与第四次相同的方法和剂量。具体实施方案见下表1。[0060]表1治疗实施方案[0062]3疗效[0063]3.1病灶大小变化[0064]治疗前测量脖颈处病灶肿块大小约为8cmX9cm如图4。治疗后3周后，肿块有明显缩小（如图6所示）。治疗5周以后（5次治疗结束），肿块基本消失（如图7所示）。治疗后12周，脖颈锁骨部位，即原病灶部位无异常变化如图8所示）。[0065]3.2肿块内部的变化[0066]治疗前，肿块内部是囊性结构，经细胞学涂片分析发现较多重度异形细胞，S卩肿瘤细胞如图5所示）。[0067]治疗后1周治疗1次），肿块明显软化如图9所示），经细胞学涂片发现含有大量中性粒细胞和少量肿瘤细胞。治疗后10天治疗2次），抽取积液约40ml;治疗后2周治疗2次），肿块内部进一步液化，抽取积液约90ml;治疗后3周（治疗3次），肿瘤已经缩小（如图10所示），继续抽取积液约45ml，经细胞学涂片发现含有大量炎性细胞和极少量肿瘤细胞，并且观察到炎性细胞包绕在肿瘤细胞外周。治疗后1个月（治疗4次），肿瘤进一步缩小，抽取积液减少到20ml左右。5次治疗结束以后，检测无积液，肿块消除。[0068]以上结果说明本发明所述基因工程菌VNP20009-M注射到肿瘤病灶内部，能够引发局部炎症细胞浸润，进而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。[0069]3.3副反应[0070]每次治疗当日，注射后9-10小时，患者发热38度左右，物理降温可恢复正常体温。当日有时伴有10分钟左右恶心呕吐。除此以外，无其他异常感觉。治疗期间，检查肝、肾功能各项指标，结果见下表2所示。结果显示，患者肝、肾功能各项指标都在正常范围。以上结果说明VNP20009-M对人体无明显毒性。[0071]表2患者各项检测指标结果[0073]以上数据证明，本发明所述基因工程菌VNP20009-M用于治疗肺癌，能够有效杀伤肺鳞癌细胞，消除肿瘤病灶，而且对人体无明显毒副作用。[0074]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

权利要求：1.基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肺癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌包括肺部原生肿瘤、肺癌术后复发肿瘤以及肺癌转移肿瘤。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞肺癌或未分化癌。5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌VNP20009-M的最低有效施用剂量为3.5*107CFUM2。6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌VNP20009-M的给药方式包括口服给药、局部给药、注射给药。7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009,所述质粒上克隆有L-methioninase基因。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述质粒包括pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009,即得。

百度查询： 广州华津医药科技有限公司 基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗肺癌药物中的应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD