申请/专利权人：青岛大学

申请日：2017-05-12

公开（公告）日：2017-09-15

公开（公告）号：CN107163109A

主分类号：C07K14/05(2006.01)I

分类号：C07K14/05(2006.01)I;C12N15/38(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;A61K39/39(2006.01)I;A61K39/245(2006.01)I;A61P37/04(2006.01)I;A61P31/22(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.10.29#发明专利申请公布后的驳回;2017.10.17#实质审查的生效;2017.09.15#公开

摘要：本发明提供了一种BALF4多肽的克隆、表达和应用，涉及分子生物学的技术领域。本发明通过基因优化，得到了优化的编码BALF4多肽的核苷酸序列，并构建了重组BALF4多肽高效表达的酵母细胞，优化了纯化方法，最终得到了BALF4多肽；本发明提供的BALF4多肽能够刺激高水平抗原特异抗体产生，诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，能够有效刺激机体免疫系统，具有较强的免疫原性，能够作为免疫佐剂，用于提高EB病毒疫苗的预防效果，从而达到有效预防EB病毒感染的目的。

主权项：一种编码BALF4多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

全文数据：BALF4多肽的克隆、表达和应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种BALF4多肽的克隆、表达和应用。背景技术[0002]EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV属于人类痕疼病毒第四型，于1964年由Epstein和Barr在研究非洲儿童恶性淋巴瘤时发现。EB病毒是一种嗜淋巴细胞病毒，是人类普遍感染的病毒之一，感染全球超过90%的人群。EB病毒因兼具较高感染率和致癌性，已于1997年被国际癌症研究中心定为I类致癌物。[0003]EB病毒经唾液或密切口腔接触传染。EB病毒主要感染B细胞和上皮细胞，其中口咽部上皮细胞是EB病毒感染与复制的首要位点。EB病毒感染主要分为四个阶段：（1通过口头传播的EB病毒在口咽部易感细胞一般为鳞状上皮细胞及侵润B淋巴细胞）中进行复制；（2在口咽部淋巴组织中EB病毒通过潜伏感染B细胞而定植于宿主体内；（3大多数情况下，EB病毒以沉默的潜伏感染方式永久存在于循环的记忆B细胞群中（主要发生在健康携带者中）；⑷EB病毒偶尔也会被激活，从潜伏感染状态转换至裂解感染状态，导致病毒再次在口咽部复制并成为传染源。EB病毒蛋白通过模拟B细胞增殖和生存信号保障病毒复制，同时又不被宿主的免疫系统识别，从而建立终生感染，这种免疫逃逸方式还有利于病毒传播。[0004]EB病毒通过包膜糖蛋白gp350gp220与B细胞2型补体受体CD21CR2结合进入并感染B细胞。三种糖蛋白（gp42，gH和gL组成的复合物与MHCII主要组织相容性复合物II结合促进病毒包膜与细胞膜的融合。病毒进入上皮细胞是由病毒BMRF2与βΐ整联蛋白的结合介导；与B细胞膜融合过程类似，gH与gL组成的复合物也参与了病毒包膜与上皮细胞膜的融合。gpllO能够提高病毒感染靶细胞的效率。此外，EB病毒还能感染T细胞，巨红细胞，粒细胞和自然杀伤NK细胞。EB病毒感染这些细胞的机制尚不明确，病毒包膜蛋白可能参与EB病毒感染T细胞及其它免疫细胞的过程。[0005]EB病毒感染能够导致传染性单核细胞增多症，25%以上的青少年感染者患有EB病毒诱发的传染性单核细胞增多症，美国每年新增约125，000例传染性单核细胞增多症病例。该症患者会出现发热、咽喉炎、头痛、淋巴结肿大、肝脏及脾脏肿大等症状;若不及时接受治疗，患者病情将进一步加重并发展为无菌性脑膜炎与重度肝炎，严重危害了青少年的健康。EB病毒还与淋巴细胞肿瘤及上皮细胞肿瘤的发生密切相关，例如，EB病毒相关的淋巴细胞肿瘤包括伯基特淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。EB病毒相关的淋巴瘤恶性程度高，发展快，并且常规化疗效果差。研究显示，全球每年新增约28,000例EB病毒相关的霍奇金淋巴瘤。EB病毒相关的上皮细胞肿瘤主要包括鼻咽癌和胃癌，数据显示，全球每年新增约78，000例EB病毒阳性鼻咽癌病例和约84,000例EB病毒阳性胃癌病例。我国的EB病毒相关鼻咽癌的发病率较高;在我国华南地区，每十万名中年男性中有50人患EB病毒阳性鼻咽癌。此夕卜，EB病毒还与免疫缺陷或免疫抑制病人中的恶性肿瘤发生密切相关。EB病毒与艾滋病毒共感染极大地增加感染者患淋巴瘤的风险，研究表明，30%-40%艾滋患者携带有EB病毒，通过抗病毒药物治疗不会降低艾滋病人中EB病毒相关淋巴瘤的发生率;因器官移植而导致免疫抑制病人中B细胞淋巴瘤发病率极高，且移植病人中B细胞淋巴瘤的致死率高达50%。[0006]鉴于EB病毒及其诱发的相关疾病的危害，现有的研究主要集中在抗EB病毒感染及其诱发肿瘤治疗两方面。针对抗病毒感染的策略主要为抗病毒药物治疗方法，抗EB病毒药物多为广谱性抗疱疹药物。EB病毒诱发肿瘤的治疗策略包括应用EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞CTL的治疗方法和采用单克隆抗体的治疗方法。T细胞介导的抗肿瘤治疗策略是通过将CTL注入患者体内，激活机体免疫系统，从而达到杀伤肿瘤的效果;CD20单克隆抗体疗法对EB病毒诱发的CD20阳性恶性肿瘤具有较好的治疗效果。然而，抗病毒药物不能有效治疗EB病毒诱发肿瘤;EB病毒相关肿瘤的治疗方法尚处于研究阶段，EB病毒特异性CTL对于器官移植后病毒诱发的恶性肿瘤治疗效果不理想，CD20单克隆抗体疗法的有效性还有待明确。因此，抗病毒疫苗成为防治EB病毒及其诱发疾病的最佳策略。[0007]抗EB病毒疫苗以包膜糖蛋白gp350为研究重点。gp350是EB病毒及其感染细胞表面最丰富的糖蛋白，也是中和抗体的首要靶标，是抗EB病毒感染的关键分子。现有研究表明，gp350能够有效诱导中和抗体反应，并能够保护免疫动物免于病毒感染及其相关肿瘤的发生。为了验证gp350的预防保护效果，美国国立卫生研究院NIH开展了gp350疫苗的临床试验，结果显示，重组gp350能够诱导gp350特异性抗体产生，并具有较好的安全性和免疫原性。另一项gp350疫苗的I期临床试验表明，该疫苗能够诱导IgG抗体与中和抗体产生。II期临床试验结果显示，gp350疫苗能够保护78%的接种者免于EB病毒诱发的传染性单核细胞增多症，并在98.7%的接种者血清中检测到gp350特异性抗体;而在疫苗接种18周后，仍能在接种者血清中检测到特异性抗体。然而，该gp350疫苗虽然能够有效降低传染性单核细胞增多症的发生率，但不能预防EB病毒的感染。[0008]综上所述，EB病毒疫苗的研制已取得一定进展，然而在疫苗研发过程中仍存在一些问题。EB病毒疫苗对实验动物具有较好的保护效果，但其临床试验结果并不理想。因此，亟需研制能够增强抗EB病毒疫苗预防保护效果的免疫佐剂。发明内容[0009]本发明的第一个目的在于提供编码BALF4多肽的核苷酸序列，本发明的第二个目的在于提供重组表达载体，本发明的第三个目的在于提供重组细胞，本发明的第四个目的在于提供BALF4多肽，本发明的第五个目的在于提供BALF4多肽的表达方法，本发明的第六个目的在于提供BALF4多肽的应用，以缓解现有技术中抗EB病毒疫苗免疫原性差的技术问题。[0010]本发明提供了一种编码BALF4多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的序列。[0011]另外，本发明还提供了包含所述核苷酸序列的重组表达载体。[0012]进一步的，所述重组表达载体源始于真核表达载体，优选的，源始于pPICZaA。[0013]另外，本发明还提供了包含所述重组表达载体的重组细胞。[00M]进一步的，所述重组细胞源始源真核细胞，优选的，源始于毕赤酵母。[0015]另外，本发明还提供了一种BALF4多肽，所述MLF4多肽具有如SEQIDN0.2所示的序列。[0016]进一步的，所述BALF4多肽具有B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，其中所述BALF4多肽中的19-26位氨基酸序列，34-41位氨基酸序列，70-81位氨基酸序列，112-137位氨基酸序列，146-172位氨基酸序列，257-264位氨基酸序列以及279-288位氨基酸序列为B细胞抗原表位;所述BALF4多肽中的22-30位氨基酸序列，32-40位氨基酸序列，68-76位氨基酸序列，91-107位氨基酸序列，171-179位氨基酸序列，185-193位氨基酸序列，216-224位氨基酸序列，311-319位氨基酸序列，287-295位氨基酸序列以及328-336位氨基酸序列为T细胞抗原表位。[0017]进一步的，所述BALF4多肽具有免疫原性。[0018]另外，本发明还提供了所述BALF4多肽的表达方法，所述表达方法包括以下步骤：[0019]a优化基因得到编码BALF4多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的序列；[0020]b将所述核苷酸序列插入PPICZaA载体中，得到重组表达载体；[0021]c将所述重组表达载体导入毕赤酵母中，得到重组酵母细胞；[0022]d培养并诱导所述重组酵母细胞，并采用亲和层析方法纯化得到所述BALF4多肽。[0023]另外，本发明还提供了所述的BALF4多肽作为免疫佐剂的应用。[0024]本发明通过优化基因，得到了优化的编码BALF4多肽的核苷酸序列，构建了重组BALF4多肽高效表达的酵母细胞，优化了纯化方法，最终得到了BALF4多肽;本发明提供的BALF4多肽能够刺激高水平抗原特异抗体产生，诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，能够有效刺激机体免疫系统，具有较强的免疫原性，能够作为免疫佐剂，用于制作疫苗，从而达到防治EB病毒及其相关疾病的目的。附图说明[0025]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0026]图1为pPICZaA_BALF4287-623的菌液PCR检测结果；[0027]图2为Western杂交方法检测重组BALF4287-623的表达；[0028]图3A为ELISA检测BALF4287-623免疫小鼠血清的IgG水平；[0029]图3B为ELISA检测BALF4287-623免疫小鼠血清的IgM水平；[0030]图4为MTT方法检测BALF4287-623诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。具体实施方式[0031]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0032]本发明提供了编码BALF4多肽的核苷酸序列，编码BALF4多肽的核苷酸序列包含SEQIDNO.1所示的序列。本发明提供的编码BALF4多肽的核苷酸序列可包括：仅SEQIDNO.1所示的序列，或者在SEQIDNO.1所示的序列的5’端或者3’端添加起始密码子、终止密码子、蛋白纯化标签或者酶切位点等序列得到的核苷酸序列。即，编码BALF4多肽的核苷酸序列可能不仅包含SEQIDNO.1所示的序列，还可能包含其他的功能性核苷酸序列。[0033]另外，本发明还提供了包含编码BALF4多肽的核苷酸序列的重组表达载体。重组表达载体的制备方法包括，通过在SEQIDNO.1所示的序列的5’端与3’端分别添加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点等操作，然后将编码BALF4多肽的核苷酸序列连接到表达载体上，得到重组表达载体。此处涉及的表达载体，表示尚不包含SEQIDNO.1所示序列的载体。其中，表达载体可以是真核表达载体，优选的，表达载体是pPICZaA。[0034]另外，本发明还提供了包含上述重组表达载体的重组细胞。重组细胞通过将上述重组表达载体导入到表达宿主中制备而成。表达宿主可以是真核细胞，优选的，表达宿主是毕赤酵母。[0035]发明人通过研究发现，将编码BALF4多肽的核苷酸序列连接到pPICZaA载体，并导入毕赤酵母中，得到的重组细胞能够高效表达具有较强免疫原性的BALF4多肽。[0036]另外，本发明还提供了BALF4多肽，BALF4多肽包含如SEQIDNO.2所示的序列。其中，SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码。此外，本发明中涉及的“重组BALF4多肽”与“BALF4多肽”意义相同。[0037]本发明提供的BALF4多肽具有B细胞和T细胞抗原表位，且具有较强的免疫原性。[0038]另外，本发明还提供了BALF4多肽的表达方法，发明人通过研究发现，将编码BALF4多肽的核苷酸序列连接到PPICZaA载体，并导入毕赤酵母中，得到的重组细胞能够高效表达具有较强免疫原性的BALF4多肽。[0039]由于本发明提供的BALF4多肽能够刺激高水平抗原特异抗体产生，诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，具有较好的免疫原性，因此本发明提供的BALF4多肽能够用作免疫佐剂，用于治疗EB病毒引起的相关疾病。[0040]为了有助于更清楚的理解本发明，现通过具体的实施例对本发明的内容进行详细的介绍。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。[0041]实施例1重组蛋白的表达及纯化[0042]一、试剂[0043]大肠杆菌DH5a:在5ml含50-100mgml卡那霉素的LB中培养过夜，取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀，转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰酒精浴中，存于-80°C。[0044]毕赤酵母重组表达载体pPICZaA:在SEQIDNO.1所示序列的5’端加上His6标签，3’端加上终止密码子，在5’端和3’端分别引入EcoRI和XbaI酶切位点;a-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因插入信号序列起始密码的读码框中。[0045]毕赤酵母GSl15菌株购自Takara。[0046]RPMI-1640培养基，反转录试剂盒，PCR试剂，限制性内切酶、T4连接酶、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自Takara。[0047]YPD培养基：1.0%酵母粉，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖，1.5%琼脂，121°C灭菌20min，毕赤酵母培养用。[0048]LB培养基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%NaCl，1.5%琼脂，pH7.0，121°C灭菌20min，加入100mgml的卡那霉素。[0049]BMGY培养基：1%酵母粉，2%蛋白胨，0.34%酵母氮源碱，1%NH42S〇4，IOOmmoIL磷酸钾缓冲液PH6.0，1%甘油。[0050]BMMY固体培养基：1%酵母粉，2%蛋白胨，0.34%酵母氮源碱，1%NH42S〇4，lOOmmolL磷酸钾缓冲液pH6.0，1%甲醇，1.5%琼脂。[0051]主要溶液：[0052]1质粒抽提溶液1:50mmolL葡萄糖，5mmolLTris-HClpH8.010mmolLEDTAρΗ8·0;[0053]2质粒抽提溶液Π:1体积0.4mmolLNaOH，1体积2%SDS，8体积水，使用前混合；[0054]3质粒抽提溶液m:5molLKAc60ml，HAc11.5ml，水（28.5ml[0055]4TE缓冲液：10mmolLTris-HCl，lmmolLEDTAρΗ8·0;[0056]550XTAE电泳缓冲液:Tris碱242g，冰醋酸57·lml，0·5molLEDTApH8·0100ml用双蒸水定容至1000ml，室温储存，用时再稀释50倍；[0057]6裂解缓冲液：200mmolLTris-HCl，pH8.5;0.5%wvSDS，250mmolLNaCl，25mmolL，EDTA;[0058]7DNA抽提缓冲液：100mmolLEDTANa2，100mmolLTris-HCl，1.5molLNaCl，pH8.0；[0059]8DEPC处理的水（简称DEPC水）：双蒸水按0.1%vv的量加入DEPC于4°C储存过夜，尚压灭菌后备用；[0060]9丁8缓冲液：10臟〇11?1口68,55111111〇11]\111：12，15111111〇11〇：12,250111111〇11KCl，用KOH调pH至6.7;[0061]10毕赤酵母转化用BufferA:I.OmolL山梨糖醇，10mmolLBicinepH8·35，30%vv乙二醇；[0062]11毕赤酵母转化用BufferB:40%wvPEG1000,0.2molLBicinepH8.35;[0063]12毕赤酵母转化用BufferC:0·15molLNaCl，lOmmolLBicinepH8·35;[0064]132\505凝胶加样缓冲液：0.5111〇111^8-!1：1册.8,21111;甘油21111;20%5052ml;0·I%溴酚蓝0.5ml;β-巯基乙醇（1.0ml;双蒸水2.5ml;[0065]145XSDS-PAGE电泳缓冲液：Tris7.5g;甘氨酸36g;SDS2.5g;溶于500ml双蒸水，使用时用去离子水稀释5倍；[0066]15SDS-PAGE胶染色液:0.25g考马斯亮蓝R250溶于90ml甲醇：水（1:1，vv和IOml冰乙酸中，滤纸过滤备用；[0067]16SDS-PAGE胶脱色液:90ml甲醇：水（1:1，vv和IOml冰乙酸；[0068]17诱导剂：甲醇。[0069]二、实验[0070]1.序列优化与合成[0071]1使用MEGA4分析BALF4蛋白序列的同源性，选定保守BALF4序列，下载其核苷酸序列^enBank序列号：LN831023.1;[0072]2通过生物信息学分析，选定BALF4多肽（287-623位氨基酸，命名为BALF4287-623作为候选抗原，进行后续检测分析。[0073]3根据毕赤酵母密码子偏好性，使用Jcat程序对BALF4287-623核苷酸序列进行密码子优化，得到SEQIDNO.1所示的序列；[0074]4设计并合成BALF4287-623序列：在SEQIDNO.1所示序列的5’端加上His6标签，3’端加上终止密码子，在优化序列的5’端和3’端分别引入EcoRI和XbaI酶切位点，并将合成序列连接到PUC57上获得重组载pUC57-BALF4287-623。[0075]2.真核表达载体的构建[0076]1载体酶切体系（50μ1如下：[0077][0078]反应条件:37°C，酶切过夜。[0079]2酶切产物经琼脂糖凝胶电泳确认酶切完全后，回收纯化酶切产物；[0080]3连接反应体系40μ1如下：[0081][0082]反应条件:22°C，连接Ih。[0083]3.重组表达载体的鉴定[0084]1取5μ1连接产物加入ΙΟΟμΙ感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min;[0085]242°C热激90s，立即于冰上放置l-2min;[0086]3加入500μ1LB液体培养基，37°C，150rpm摇菌50min;[0087]4离心，收集菌体沉淀，重悬菌体；[0088]5在超净工作台中，将细胞悬液均匀涂布在含25ygmlZeocin的低盐LB平板上，37°C培养过夜。[0089]4.重组质粒的提取与鉴定[0090]1挑取转化单菌落，接种至5mlLB液体培养基中（含25ygmlZeocin，37°C，300rpm培养8h;[0091]2取150μ1细菌悬液接种至100ml液体LB中扩大培养，37°C，300rpm培养12-16h;[0092]3提取重组质粒，经质粒双酶切和测序分析鉴定重组表达载体如图1。[0093]5.重组多肽在毕赤酵母中的诱导表达[0094]挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于25mlBMGY液体培养基中（按10%装瓶），28°C，200rpm摇床培养至OD6qq=4-6。收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至25mlBMMY液体培养基中，200rpm，25°C摇床培养。每隔24h补加甲醇至终浓度5%进行诱导，0，1211，2411，36h，48h，72h，96h取样分析表达水平，以确定最佳诱导时间。结果表明诱导72h小时表达水平最佳。[0095]6.SDS-PAGE和Western杂交方法检测重组多肽的表达[0096]待重组毕赤酵母经诱导表达后，取少许培养上清，离心，取上清，通过SDS-PAGE和Western杂交方法检测重组蛋白表达。[0097]7.重组蛋白的纯化[0098]将已鉴定的重组毕赤酵母进行甲醇诱导表达后，离心收集上清液，加入80%饱和度硫酸铵沉淀过夜。4°C，IOOOOrpm离心lOmin，弃上清，蛋白沉淀用0.1倍体积的0.05M磷酸缓冲液pH6溶解，并采用0.05M磷酸缓冲液pH6进行透析去盐。将蛋白液过滤后，上到Ni-NTA亲和层析柱GEHealthcare中。采用0.05M磷酸缓冲液pH6进行平衡，再采用含200mM咪唑的0.05M磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白，重组蛋白的纯化结果如图2所不。[0099]实施例2重组表达蛋白免疫刺激活性检测[0100]—、试剂[0101]ELISA包被缓冲液pH9.6,1L:溶解1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3于IL双蒸水中。[0102]ELISA洗涤缓冲液（pH7.4，1L:称取0.2g固体KH2P〇4,2.9gNa2HPO4·12H20,8gNaCl和0.2gKCl溶解于IL双蒸水中，再加入0.5ml吐温20,混匀备用。[0103]二、实验[0104]1.小鼠免疫实验[0105]BALBc小鼠（雌性，4-6周龄购自青岛市食品药品检验所，按照山东省动物管理条例在青岛大学动物中心饲养，动物实验室为SPF级。将小鼠分为三组，每组10只，第一组为对照组，每隔两周每只小鼠皮下注射1〇〇μ1PBS—次，共免疫三次;第二组为BALF4287-623免疫组，每隔两周每只小鼠皮下注射IOygBALF4287-623溶于ΙΟΟμΙPBS—次，共免疫三次;第三组为BALF4287-623+FA免疫组，第一次每只小鼠皮下注射IOygBALF4287-623溶于50μ1PBS与等体积弗式完全佐剂（Sigma混合液，此后每隔两周每只小鼠皮下注射IOygBALF4287-623溶于50μ1PBS与等体积弗式不完全佐剂Sigma混合液，免疫两次。每次免疫前及最后一次免疫两周后采集小鼠血样。[0106]2.ELISA检测[0107]采用ELISA检测小鼠免疫血清中IgG和IgM水平，结果如图3Α和图3Β所示。[0108]1包被抗原：包被缓冲液稀释抗原至浓度为50ngBALF4287-623100μ1，每孔加入100μ1，4Γ孵育过夜；[0109]2洗涤:移去包被液，加入250μ1洗涤缓冲液，洗板3次，每次5min;[0110]3封闭：每孔加入200μ13%BSA，37°C封闭lh;[0111]4洗涤:加入250μ1洗涤缓冲液洗板5次，每次4min;[0112]5加入待检测血清:每孔加入ΙΟΟμΙPBST稀释的待测血清，置于37°C孵育l_2h;[0113]6洗涤:同步骤⑷；[0114]7加入二抗，37°C孵育Ih;[0115]8洗涤：同步骤⑷；[0116]9显色：加入TMB显色液，室温显色5-20min，加入2M硫酸终止反应，酶标仪下测定OD450〇[0117]3.小鼠脾脏淋巴细胞的分离与培养[0118]1最后一次免疫两周后，每组取3-5只小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，在75%酒精中浸泡小鼠后，无菌条件下取出小鼠脾脏；[0119]2将脾脏置于200目尼龙网上充分研磨至Iml淋巴细胞分离液中，将分离液转至干净离心管中，并沿管壁缓慢加入200μ1RPMI-1640培养基；[0120]34°C，800Xg离心30min后，吸取中间淋巴细胞层；[0121]4加入RPMI-1640培养基充分清洗细胞后计数；[0122]5将淋巴细胞悬液加至96孔板中，加入相应抗原后进行体外培养。[0123]4.淋巴细胞增殖实验[0124]采用MTT检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应如图4，具体步骤如下：[0125]1小鼠脾脏淋巴细胞按照IXIO6细胞孔的密度，取ΙΟΟμΙ细胞悬液加至96孔板中，加入相应抗原后，将96孔板置于37°C，5%CO2无菌培养箱中；[0126]2培养72h后，每孔加入10μ1MTT溶液5mgml，PBS配制），继续培养4h;[0127]3I,OOOrpm离心lOmin，小心吸去上清，每孔加入ΙΟΟμΙDMSO后置于摇床低速振荡IOmin，使结晶物充分溶解；[0128]4检测OD570后，计算各组刺激指数SI〇[0129]SI计算公式如下：[0130]SI=抗原刺激组OD57Q平均值阴性对照组OD57Q平均值。[0131]本发明中采用毕赤酵母表达系统获得重组BALF4多肽，具有以下优势：1成本低；2基因操作方便;3表达稳定;4生长迅速;5产量高。毕赤酵母系统能够将外源蛋白分泌至培养上清中，而毕赤酵母自身分泌较少的内源蛋白，因此，重组细胞诱导上清中的蛋白组分主要为外源重组蛋白，便于后续的蛋白纯化工作。此外，通过大规模发酵，在毕赤酵母系统中可获得高产量的重组蛋白，从而有利于重组蛋白的工业化生产。[0132]本发明从体液与细胞免疫水平检测重组多肽的免疫原性。重组多肽能够刺激高水平抗原特异抗体的产生，诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。这些结果表明，重组BALF4多肽能够有效诱导体液免疫和细胞免疫反应，能够作为EB病毒疫苗佐剂，提高EB病毒疫苗的预防效果，从而达到有效预防EB病毒感染的目的。[0133]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

权利要求：1.一种编码BALF4多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的序列。2.包含权利要求1所述的核苷酸序列的重组表达载体。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体源始于真核表达载体，优选的，源始于pPICZaA。4.包含权利要求2或者3所述的重组表达载体的重组细胞。5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞源始于真核细胞，优选的，源始于毕赤酵母。6.—种BALF4多肽，其特征在于，所述BALF4多肽包含如SEQIDNO.2所示的序列。7.根据权利要求6所述的BALF4多肽，其特征在于，所述BALF4多肽具有B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，其中所述BALF4多肽中的19-26位氨基酸序列，34-41位氨基酸序列，70-81位氨基酸序列，112-137位氨基酸序列，146-172位氨基酸序列，257-264位氨基酸序列以及279-288位氨基酸序列为B细胞抗原表位;所述BALF4多肽中的22-30位氨基酸序列，32-40位氨基酸序列，68-76位氨基酸序列，91-107位氨基酸序列，171-179位氨基酸序列，185-193位氨基酸序列，216-224位氨基酸序列，311-319位氨基酸序列，287-295位氨基酸序列以及328-336位氨基酸序列为T细胞抗原表位。8.根据权利要求6所述的BALF4多肽，其特征在于，所述BALF4多肽具有免疫原性。9.权利要求6所述BALF4多肽的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：a优化基因得到编码BALF4多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的序列；⑹将所述核苷酸序列插入PPICZaA载体中，得到重组表达载体；c将所述重组表达载体导入毕赤酵母中，得到重组酵母细胞；d培养并诱导所述重组酵母细胞，并采用亲和层析方法纯化得到所述BALF4多肽。10.权利要求6所述的BALF4多肽作为免疫佐剂的应用。

百度查询： 青岛大学 BALF4多肽的克隆、表达和应用

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